壓力性尿失禁大鼠中環(huán)氧合酶2表達(dá)的變化及意義

李 江，楊智明，柯 建，Prashant Mishra，羅 偉，劉 上，劉建和，袁志偉，孫 浩，楊昭慶，方克偉

0 引 言

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是指在活動(dòng)、咳嗽或打噴嚏等腹壓升高時(shí)尿液不自主流出，60歲以上婦女中發(fā)病率高達(dá)8.0%［1-2］。SUI手術(shù)治療有較好的效果［3］，但關(guān)于SUI發(fā)病的分子機(jī)制研究較少。關(guān)于SUI發(fā)病機(jī)制研究有TGF信號傳導(dǎo)相關(guān)的Smad2，膠原蛋白降解相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶［4］，炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞趨化因子［5］，抑制平滑肌的G蛋白信號調(diào)節(jié)因子2［3］等方面。而環(huán)氧合酶 2（Epoxygenase 2，COX?2）與 SUI的關(guān)系報(bào)道較少。

COX?2是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶，前列腺素幾乎在所有下尿路組織中均有表達(dá)。COX?2已被證明直接參與了間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征［6］、膀胱過度活動(dòng)癥［7］、神經(jīng)源性逼尿肌過度活動(dòng)［7］等疾病過程，導(dǎo)致了尿頻、尿急、流出道阻力下降等癥狀。截止2018年8月26日，COX?2在SUI陰道、尿道的表達(dá)變化未見報(bào)道，與SUI的關(guān)聯(lián)尚不清楚［8］。經(jīng)陰道分娩和雌激素下降被認(rèn)為是SUI重要的誘因，但雌激素下降對SUI患者尿道中COX?2表達(dá)的影響仍不清楚。本研究將檢測COX?2在SUI大鼠模型中的尿道、陰道、尿道平滑肌中的表達(dá)變化，并推測雌激素對COX?2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料健康雌性未育SD大鼠60只，雄性SD大鼠15只，4周齡，體重230～280g，平均（255±25）g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號：SCXK（滇）K2015?0002。雌雄大鼠4∶1合籠，自然妊娠，取分娩后18只雌性大鼠用于后面實(shí)驗(yàn)研究。COX?2抗體（（D5H5）XP? Rabbit mAb，CellSignal?ingCST公司）；β?Tubulin抗體（（9F3）Rabbit mAb，美國CellSignalingCST公司）；二抗（Antibody To Rabbit IgG（H+L）Peroxidase?Labeled，KPL公司）。

1.2 動(dòng)物模型建立參考Lin等［9］的建模方式利用擴(kuò)張陰道（單純擴(kuò)張組）、擴(kuò)張陰道+切除卵巢（擴(kuò)張＋切除組）2種方式建立SUI模型，另使用正常妊娠分娩后大鼠為對照組，共3組，每組6只。

1.3 動(dòng)物模型驗(yàn)證

1.3.1 尿動(dòng)力學(xué)檢查單純擴(kuò)張組、擴(kuò)張+切除組、對照組大鼠分別用尿動(dòng)力檢查儀（Laborie TUB500，加拿大）測最大膀胱容量（maximum bladder capaci?ty，MBC）和腹壓漏尿點(diǎn)壓（abdominal leak point pres?sure，ALPP）。具體方法參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行改進(jìn)，在斑馬導(dǎo)絲引導(dǎo)下將硬膜外導(dǎo)管自尿道口插人膀胱，插人約3 cm。硬膜外導(dǎo)管通過三通管與尿流動(dòng)力學(xué)檢測儀及微量輸液泵相連進(jìn)行測量。測量并記錄MBC、ALPP。

1.3.2 噴嚏實(shí)驗(yàn)利用SD大鼠鼠須伸入鼻腔內(nèi)，誘發(fā)其打噴嚏，打噴嚏時(shí)有尿液流出為陽性，反之則為陰性。

1.4 組織標(biāo)本獲取與保存每組隨機(jī)挑選6只大鼠，處死后完整取出其尿道、陰道。每個(gè)標(biāo)本分別加入4%中性甲醛固定液和RNAlater保存液，均保存于-80℃冰箱。

1.5 COX?2 mRNA水平表達(dá)檢測取100 mg組織加入液氮研磨成粉末，使用總RNA提取試劑盒進(jìn)行 RNA 提取，利用 PrimeScript RT reagent Kit（TA?KARA，中國）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設(shè)計(jì)引物序列為：上游引物5 ?CTGTTCCAACCCATGTCAAAACC?3’，下游引物5’?GTACAGTTTTCACCGTAGAATCCA?3’。利用SYBR熒光定量試劑盒（TAKARA，中國）進(jìn)行檢測。

1.6 COX?2蛋白水平表達(dá)檢測取組織液氮下研磨，使用RIPA裂解液和超聲細(xì)胞破碎機(jī)裂解組織及細(xì)胞，12 000轉(zhuǎn)/min、離心半徑10 cm，離心10 min后取上清液，BCA法測定總蛋白濃度，利用Western blot法以β?tubulin作為內(nèi)參進(jìn)行COX?2蛋白檢測及組間比較。

1.7 COX?2免疫組化分析每只大鼠分別取尿道、陰道分別做石蠟切片，使用COX?2行免疫組化，并參照文獻(xiàn)［9］的免疫組化半定量法對染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，多組間均值的比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD法；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 噴嚏實(shí)驗(yàn)及尿動(dòng)力學(xué)檢查結(jié)果擴(kuò)張+切除組陽性率（18/20，90%）明顯高于單純擴(kuò)張組（12/20，60%）及對照組（0%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3個(gè)組MBC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。擴(kuò)張+切除組、單純擴(kuò)張組ALPP較對照組明顯下降，擴(kuò)張+切除組較單純擴(kuò)張組明顯下降（P＜0.05），見表1。

表1 SD大鼠尿動(dòng)力檢查結(jié)果（±s）Table 1 Results of urodynamic examination in SD rats（±s）

表1 SD大鼠尿動(dòng)力檢查結(jié)果（±s）Table 1 Results of urodynamic examination in SD rats（±s）

1 cmH2O=0.98kPa與對照組比較，*P ＜0.05；與單純擴(kuò)張組比較，＃ P ＜0.05

組別對照組單純擴(kuò)張組擴(kuò)張+切除組n 6 6 6最大膀胱容積（mL）2.82±0.40 2.77±0.49 2.78±0.39漏尿點(diǎn)壓（cmH2O）64.85±2.44 45.20±2.78 44.75±2.33*＃

2.2 COX?2 mRNA及蛋白的表達(dá)熒光定量PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，單純擴(kuò)張組、擴(kuò)張+切除組 COX?2mRNA 表達(dá)［（1.400±0.074）、（1.750±0.098）］、蛋白的相對表 達(dá)量［（1.640±0.045）、（1.950 ± 0.077）］較對 照 組［（1.00 ± 0.16）、（0.77±0.26）］明顯升高（P＜0.001）；擴(kuò)張+切除組較單純擴(kuò)張組明顯升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Western blot檢測SD大鼠COX?2蛋白水平的表達(dá)Figure 1 Expression of COX?2 protein level by western blot

2.3 COX?2免疫組化結(jié)果COX?2在尿道上皮組織表達(dá)未見明顯變化，對照組、單純擴(kuò)張組、擴(kuò)張+切除組染色強(qiáng)度表達(dá)積分分別為 1.00±0.89、1.16±0.75、1.00±0.63，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。陰道組織中，COX?2主要表達(dá)在上皮細(xì)胞質(zhì)，對照組、單純擴(kuò)張組、擴(kuò)張+切除組COX?2的染色強(qiáng)度表達(dá)積分分別為0.50±0.54、5.55±0.54、9.33±0.81，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。尿道平滑肌組織，COX?2主要表達(dá)在平滑肌細(xì)胞質(zhì)，對照組、單純擴(kuò)張組、擴(kuò)張+切除組染色強(qiáng)度表達(dá)分別為0.66±0.51、5.33±0.51、8.50±0.54，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見圖4。

圖2 SD大鼠COX?2尿道上皮組織中的免疫組化表達(dá)Figure 2 Immunohistochemical expression of COX2 in vaginal tissues of three groups of SD rats

圖3 SD大鼠COX?2陰道組織中的免疫組化表達(dá)Figure 3 Immunohistochemical expression of COX2 in vaginal tissues of three groups of SD rats

圖4 SD大鼠COX?2在尿道平滑肌組織中的免疫組化表達(dá)Figure 4 Immunohistochemical expression of COX2 in urethral smooth muscle of SD rats

3 討 論

產(chǎn)傷與雌激素下降被認(rèn)為是SUI的主要誘因。在經(jīng)歷妊娠和陰道分娩的女性中約1/3遭受過尿失禁。本研究利用擴(kuò)張陰道和切除卵巢建立SUI動(dòng)物模型來模擬這2種疾病誘因。單純擴(kuò)張組和擴(kuò)張+切除組ALPP較對照組降低，而MBC卻無明顯差別，表現(xiàn)為流出道阻力下降為主，根據(jù)Dokmeci等［10］可確定尿失禁的類型。

目前尚無COX?2在SUI中表達(dá)變化的直接證據(jù)。de Jongh等［11］在離體的膀胱的上皮層、粘膜層、肌層的細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)有COX?2的表達(dá)。也有報(bào)道COX?2在細(xì)胞核外表達(dá)［12］。本研究陰道和尿道肌層的COX?2主要表達(dá)于細(xì)胞漿中。COX?2在3組尿道上皮中表達(dá)無明顯變化。與之相似，Marentette等［5］發(fā)現(xiàn)COX?2在正常人的已分化的尿路上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)升高，而在IC/PBS患者的尿路上皮細(xì)胞則未見COX?2表達(dá)。COX?2已證實(shí)對上皮細(xì)胞有保護(hù)作用［13］。這些數(shù)據(jù)提示了COX?2在上皮細(xì)胞的表達(dá)與分化階段、病理狀態(tài)有關(guān)。

COX?2在尿道平滑肌層中的表達(dá)變化與下尿路癥狀有關(guān)。Comeglio等［14］發(fā)現(xiàn)COX?2在慢性前列腺炎患者的尿道平滑肌層受到炎癥因子的誘導(dǎo)表達(dá)升高。膀胱過度活動(dòng)癥患者的膀胱粘膜層及平滑肌層COX?2的表達(dá)升高［15］，而COX?2抑制劑灌注可改善膀胱過度活動(dòng)癥患者的癥狀［16］。間質(zhì)細(xì)胞廣泛位于下尿路的平滑肌層并參與調(diào)節(jié)平滑肌的收縮。Hashitani等［17］發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞通過COX?2的活性和表達(dá)來調(diào)節(jié)肌肉自發(fā)的電活動(dòng)。本研究中同樣觀察到COX?2在SUI模型的平滑肌層中表達(dá)升高。COX?2與平滑肌的收縮相關(guān)，而尿道的閉合壓力能提供主要的尿道阻力。平滑肌中COX?2的表達(dá)變化可能與SUI發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

雌激素已被證實(shí)與SUI的發(fā)病相關(guān)，血清雌激素下降，可出現(xiàn)尿道萎縮、陰道干澀瘙癢。本研究中擴(kuò)張+切除組中COX?2在陰道及尿道平滑肌中的表達(dá)均高于單純擴(kuò)張組及對照組，可能是雌激素下降導(dǎo)致的結(jié)果。由于COX?2基因啟動(dòng)子含有雌激素結(jié)合位點(diǎn)，可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞COX?2的活性及促進(jìn)前列腺素的生成。在其他組織中也觀察到相似的情況，Murakami等［18］發(fā)現(xiàn)雌激素水平下降或絕經(jīng)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜息肉中COX?2的高表達(dá)。雌激素受體廣泛分布于在膀胱三角區(qū)、尿道上皮和固有層、平滑肌層、陰道粘膜，肛提肌等組織的細(xì)胞核內(nèi)。雌激素替代治療特別是局部用藥被認(rèn)為是有效的SUI的治療方式。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)雌激素下調(diào)了牛的軟骨細(xì)胞和分泌型上皮細(xì)胞COX?2的表達(dá)。雌激素替代治療改善SUI癥狀的同時(shí)有可能下調(diào)尿道陰道中COX?2的表達(dá)，這可能為這種治療提供新的證據(jù)支持。

實(shí)驗(yàn)對象SD大鼠妊娠期盆底所承受的壓力小于婦女，尿動(dòng)力學(xué)檢查時(shí)大鼠為麻醉狀態(tài)，測量情況可能與受到影響［19］。但是，本研究進(jìn)行了模型的驗(yàn)證，使動(dòng)物模型盡量能夠代表人類疾病過程。

綜上所述，本研究顯示SUI大鼠模型的陰道、尿道平滑肌中COX?2表達(dá)升高，尿道上皮無明顯變化。切除卵巢后可能引起雌激素下降，導(dǎo)致SUI大鼠下尿道COX?2表達(dá)升高，COX?2表達(dá)的上調(diào)可能與SUI的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。