肉蓯蓉微型飲片切制工藝優(yōu)化

李祥溦， 李 喆， 任曉航， 魏曉峰， 劉博男， 史 輯，，?

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局炮制原理解析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116600；3.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧大連 116600）

肉蓯蓉為列當(dāng)科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma或管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖。具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤(rùn)腸通便的功效[1］。其主要活性成分為苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷類、寡糖類等[2-4］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明肉蓯蓉具有延緩衰老[5］、抗疲勞[6］等作用。臨床上主要用于腎陽不足、精血虧虛、陽痿不孕、腰膝酸軟、筋骨無力等癥，為常用的補(bǔ)腎壯陽藥[7-8］。

中藥飲片是經(jīng)過炮制能直接用于中醫(yī)臨床和中成藥生產(chǎn)的處方藥，是國(guó)家基本藥物，是中醫(yī)臨床處方藥。目前臨床上肉蓯蓉飲片大多以直徑4～5 cm，厚度0.5～1 cm的大厚片為主[4］，這種傳統(tǒng)的飲片不僅在抓藥時(shí)難以把控質(zhì)量，而且在煎煮時(shí)也不利于有效成分的煎出，不利于中藥飲片的規(guī)范使用[9］。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏加快，采用傳統(tǒng)秤稱手抓的調(diào)劑方式，速度慢，精準(zhǔn)度不夠，煎出率低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，影響了飲片在臨床的使用。2015年賈天柱提出了微型飲片的概念[10］。所謂微型飲片是指直徑在0.5～1.0 cm左右的丁塊狀飲片，具有流動(dòng)性好、煎出率高的特點(diǎn)。在保證藥材原有的藥效與性狀的前提下，對(duì)其進(jìn)行更加精細(xì)的切制，使飲片更小更均勻，更有利調(diào)劑人員的稱定，有效成分的煎出[11］。與之相匹配的是，飲片調(diào)劑需要實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和智能化[12］。因此微型飲片切制工藝研究的目的就是提高調(diào)劑人員工作效率，便于患者取藥，讓中藥調(diào)劑接近西藥調(diào)劑，讓有限的飲片煎出更多的成分。

本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)的方法，以飲片截面直徑、厚度、軟化時(shí)間、干燥溫度為影響因素，以休止角、浸出物、毛蕊花糖苷、松果菊苷、異類葉升麻苷等化學(xué)成分的含有量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)肉蓯蓉微型飲片的切制工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)建立不同產(chǎn)地肉蓯蓉微型飲片的指紋圖譜，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 E2695-2998型高效液相色譜儀 （美國(guó)Waters公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 （超聲功率250 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀有限公司）；AE240型電子分析天平 （十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 材料 肉蓯蓉購(gòu)自內(nèi)蒙古王爺?shù)厣惾赜邢薰?（直徑約3 cm，長(zhǎng)約15 cm）和內(nèi)蒙古阿拉善藥材市場(chǎng)購(gòu)買的荒漠肉蓯蓉藥材10批。經(jīng)過遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為列當(dāng)科植物肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖；松果菊苷對(duì)照品 （批號(hào)MUST-13080801，含有量≥98%）、毛蕊花糖苷對(duì)照品 （批號(hào)MUST-13122711，含有量≥98%）、異類葉升麻苷對(duì)照品 （批號(hào) MUST-15081001M，含有量≥99.77%），均由成都曼斯特生物技術(shù)有限公司提供。乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 有效成分測(cè)定

2.1.2 樣品溶液制備 取同一批次肉蓯蓉藥材9份，選擇飲片截面直徑 （A）、飲片厚度 （B）、軟化時(shí)間 （C）、干燥溫度 （D）為考察因素，凈制后按照正交試驗(yàn)表中的潤(rùn)制時(shí)間軟化，制備成表中所述的各規(guī)格微型飲片，再以不同的烘干溫度烘干，即得。見表1。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱定各肉蓯蓉微型飲片10 g，置于200 mL圓底燒瓶中，依次加入100、80、80 mL水加熱回流3次，每次1 h。合并提取液，置于500 mL量瓶中，定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.1.4 色譜條件 Ecosil C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇 （A） -0.1%甲酸水溶液 （B），梯度洗脫 （0～45 min， 30% ～45%A； 45～50 min， 45% ～30%A；50～60 min，30%A）；體積流量1 mL／min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng) 330 nm； 進(jìn)樣量 10 μL[13］。 見圖 1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖1 各成分HPLC色譜圖

2.1.5 線性關(guān)系考察 取混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、20 μL，在 “2.1.4”項(xiàng)條件下測(cè)定，以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2。

表2 各成分線性關(guān)系

2.1.6 精密度試驗(yàn) 吸取同一濃度混合對(duì)照品，在“2.1.4”項(xiàng)條件下測(cè)定6次，測(cè)得毛蕊花糖苷、松果菊苷、異類葉升麻苷峰面積的RSD依次為1.5%、1.7%、1.8%，表明該儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次、同一方法處理的肉蓯蓉微型飲片6份，每份精密稱取10 g，按 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1.4”項(xiàng)條件下測(cè)定，測(cè)得毛蕊花糖苷、松果菊苷、異類葉升麻苷峰面積RSD分別為1.7%、1.5%、1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

1) 一個(gè)問題可以首先被粗粒度地劃分為若干子問題，CUDA使用塊(Block)單元處理子問題，每個(gè)塊都由一些CUDA線程組成，線程是CUDA中最小的處理單元。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份肉蓯蓉微型飲片的樣品溶液，在 “2.1.4”項(xiàng)條件下，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，測(cè)得毛蕊花糖苷、松果菊苷、異類葉升麻苷的峰面積RSD分別為1.6%、1.7%、1.5%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定含各成分，經(jīng)同一方法處理的肉蓯蓉微型飲片6份，每份10 g，按比例加入對(duì)照品溶液，按 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.4”項(xiàng)條件下測(cè)定，測(cè)得毛蕊花糖苷、松果菊苷、異類葉升麻苷的含有量，并計(jì)算平均加樣回收率分別為99.7%（RSD 1.5%）、 102.1%（RSD 1.7%）、 97.3% （RSD 1.5%）。

2.2 出膏率測(cè)定 取切制的肉蓯蓉飲片各10 g，置于200 mL圓底燒瓶中，分別加入100、80、80 mL水加熱回流3次，每次1 h。將每次回流提取液過濾后合并，減壓濃縮至適量，將濃縮液轉(zhuǎn)移至干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃下干燥3 h，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率。公式為C＝M／m×100% （C為出膏率，M為藥材干質(zhì)量，m為干燥浸出物質(zhì)量）。

2.3 休止角測(cè)定 采用傾斜法進(jìn)行測(cè)定。于矩形盒內(nèi)裝滿飲片，松實(shí)程度適中，將盒子逐漸傾斜至飲片開始傾出為止，其傾斜的角度即為休止角。設(shè)傾斜角的高為H，底邊為L(zhǎng)， 計(jì)算休止角θ， 公式為tanθ＝H／L。

2.4 最佳切制工藝優(yōu)選 采用正交設(shè)計(jì)L9（34）優(yōu)選肉蓯蓉微型飲片的最佳切制工藝，以毛蕊花糖苷、松果菊苷、異類葉升麻苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇飲片截面直徑 （A）、飲片厚度 （B）、軟化時(shí)間 （C）、干燥溫度 （D）為考察因素，見表3。以綜合加權(quán)評(píng)分法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。見表4～5。再根據(jù)綜合水平計(jì)算公式進(jìn)行評(píng)分，公式為綜合評(píng)分＝40X／Xmax+40Y／Ymax+20Zmin／Z （X 為肉蓯蓉微型飲片中毛蕊花糖苷、松果菊苷、異類葉升麻苷總量，Y為肉蓯蓉微型飲片的出膏率，Z為肉蓯蓉微型飲片的休止角。）

表3 因素水平

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表5 方差分析

在肉蓯蓉微型飲片切制工藝中，飲片橫截面直徑（A）、飲片的厚度 （B）均具有顯著影響，而軟化時(shí)間（C）、干燥溫度 （D）均無顯著影響。根據(jù)生產(chǎn)需要藥材不宜過硬、干燥時(shí)間不宜過長(zhǎng)且能耗低，因此，最優(yōu)工藝確定為飲片截面直徑3～4 mm，飲片厚度1～2 mm，潤(rùn)制時(shí)間2 h，干燥溫度70℃。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 分別按照最佳切制工藝切制肉蓯蓉微型飲片3份，每份10 g，依次加入100、80、80 mL水加熱回流3次，每次1 h。合并提取液，置于500 mL量瓶中，定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，在 “2.1.4”項(xiàng)條件下，測(cè)定毛蕊花糖苷、松果菊苷、異類葉升麻苷含有量，結(jié)果見表6，測(cè)得總含有量的平均值為1.18%，表明該切制工藝條件具有可操作性、重復(fù)性好，適用于肉蓯蓉飲片有效成分的提取。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.6 傳統(tǒng)切制工藝 取傳統(tǒng)大厚片工藝切制的肉蓯蓉飲片3份，每份10 g，按 “2.5”項(xiàng)下方法提取，測(cè)定毛蕊花糖苷、松果菊苷、異類葉升麻苷含有量，結(jié)果見表7，測(cè)得總含有量的平均值為0.67%，結(jié)果表明，與傳統(tǒng)切制相比，微型飲片的切制工藝顯著提高了肉蓯蓉飲片中有效成分的提取效率。

表7 傳統(tǒng)切制工藝提取結(jié)果

3 指紋圖譜建立[4］

選取在內(nèi)蒙古阿拉善藥材市場(chǎng)購(gòu)買的荒漠肉蓯蓉藥材10批，按 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.4”項(xiàng)下條件下進(jìn)樣，得到液相色譜圖，導(dǎo)入 “中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2004 A版，進(jìn)行校正和匹配，即得肉蓯蓉微型飲片的指紋圖譜及相似度。結(jié)果見圖2， 表 8。

圖2 10批樣品HPLC指紋圖譜

表8 10批樣品相似度

3.1 對(duì)照品溶液制備 同 “2.1.1”項(xiàng)下方法。

3.2 供試品溶液制備 同 “2.1.3”項(xiàng)下方法。

3.3 色譜條件 同 “2.1.4”項(xiàng)下方法。

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一產(chǎn)地巴戟天供試品溶液，在 “2.1.4”項(xiàng)條件下連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得各色譜峰保留時(shí)間、峰面積RSD值均小于2%，表明該儀器精密度良好。

3.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一產(chǎn)地巴戟天供試品溶液，在 “2.1.4” 項(xiàng)條件下于 0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、24 h分別進(jìn)樣，測(cè)得各色譜峰保留時(shí)間、峰面積RSD值均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一產(chǎn)地巴戟天飲片，平行制備6份供試品溶液，在 “2.1.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得各色譜峰保留時(shí)間、峰面積RSD值均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.5 結(jié)果分析 通過對(duì)10批次肉蓯蓉藥材的指紋圖譜鑒定，共分離得37個(gè)色譜峰，其中16個(gè)為共有指紋色譜峰，與對(duì)照品比對(duì)確定了其中3個(gè)指標(biāo)性成分，分別為毛蕊花糖苷、松果菊苷、異類葉升麻苷。將原始微型飲片的色譜圖作為參照?qǐng)D譜，與其他10個(gè)不同產(chǎn)地的肉蓯蓉微型飲片色譜圖對(duì)比，相似度均到達(dá)90%以上，符合指紋圖譜的要求，表明該工藝適用于大多數(shù)批次肉蓯蓉藥材。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)所使用的肉蓯蓉藥材均按照藥典方法進(jìn)行了含有量測(cè)定，其毛蕊花糖苷、松果菊苷的含有量均符合2015年版 《中國(guó)藥典》的相關(guān)規(guī)定 （毛蕊花糖苷、松果菊苷的總量不得少于0.3%）。

傳統(tǒng)中藥飲片一般用水煎煮[15］，本實(shí)驗(yàn)所得的微型飲片的提取工藝也均使用水為提取溶劑，加熱回流的方式進(jìn)行提取?？勺畲蟪潭壬媳ＷC與臨床用藥煎煮習(xí)慣相吻合，提高臨床用藥的針對(duì)性。

將微型飲片與傳統(tǒng)大厚片的提取比較分析，表明微型飲片在出膏率、有效成分的煎出率方面明顯要優(yōu)于傳統(tǒng)的大厚片，這可能是因?yàn)轱嬈w積減小，同質(zhì)量飲片與提取溶劑的接觸面積增大，有效成分提取更完全，體現(xiàn)了微型飲片的合理性與可行性。同時(shí)，休止角概念的引入，證明微型飲片的流動(dòng)性較好，有利于研制和使用相應(yīng)的調(diào)劑設(shè)備[16］，提高調(diào)劑室的調(diào)劑速度，為患者和醫(yī)護(hù)人員節(jié)省更多時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)采用含有量測(cè)定與特征性圖譜相結(jié)合的方法全面整體評(píng)價(jià)工藝的合理性，不僅能在化學(xué)成分含有量方面直觀的體現(xiàn)出微型飲片切制工藝的優(yōu)點(diǎn)及合理性，也能體現(xiàn)其普遍適用性。

中藥飲片的炮制具有悠久的歷史，其中尤以切制歷史最為悠久。中藥材經(jīng)過切制才能被稱為飲片[16］，但是長(zhǎng)久以來中藥飲片的發(fā)展卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于臨床需要?，F(xiàn)代中藥的種植、采收、加工越來越規(guī)范，對(duì)于中藥飲片的要求也越來越高。為了使中藥飲片達(dá)到規(guī)格化一，流動(dòng)可調(diào)的要求，微型飲片應(yīng)運(yùn)而生，將傳統(tǒng)飲片的規(guī)格化大為小，達(dá)到可隨意分配與調(diào)劑的程度[17］，這區(qū)別于原藥材和粉末藥材，除了具有較好的流動(dòng)性外，還不失去藥材原有的性狀，煎煮時(shí)更不會(huì)糊鍋，調(diào)配也更加方便快捷。微型飲片具有廣闊的應(yīng)用前景，也是中藥飲片的發(fā)展趨勢(shì)。