瓜蔞薤白半夏膠囊提取工藝的優(yōu)化

黃 涵， 王宇卿

（南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南南陽 473061）

瓜蔞薤白半夏湯源自張仲景 《金匱要略》，由瓜蔞、薤白、半夏組成，具有宣痹通陽、除痰散結(jié)、行氣止痛之功效，臨床上廣泛用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗死、高脂血癥等心血管疾病[1-3］，療效確切。該方以湯劑入藥，但攜帶不便，口感不佳，而且熬制過程繁復(fù)，故本實(shí)驗(yàn)擬將其開發(fā)為穩(wěn)定性高、服用與攜帶方便的膠囊劑。目前，關(guān)于瓜蔞薤白半夏湯方的研究主要集中在藥理活性方面，而鮮有其提取工藝的報(bào)道，故確定該方合理的提取工藝對(duì)保證其相關(guān)制劑質(zhì)量和臨床療效具有重要意義。

研究表明，瓜蔞薤白半夏湯中的主要活性成分腺苷具有促進(jìn)血管擴(kuò)張、降低血壓的作用[4-5］，鳥苷具有舒張主動(dòng)脈血管的作用[6］，薤白皂苷具有抗血小板凝聚、降脂的作用[7-8］，這些成分的藥理活性與該方主要藥效相吻合，故可作為提取工藝中的重要指標(biāo)成分。

Box-Behnken響應(yīng)面法是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，它采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、回歸方程精度高等特點(diǎn)，而且能研究幾種因素間的交互作用，相比常用的均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)顯示出明顯優(yōu)勢(shì)[9-11］。因此，本實(shí)驗(yàn)以腺苷、鳥苷、總皂苷提取量和干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在遵循古方 “白酒同煮，可通陽宣痹，輕揚(yáng)善行以助藥勢(shì)”的前提下確定藥材提取溶劑為乙醇，并通過Box-behnken響應(yīng)面法優(yōu)化瓜蔞薤白半夏膠囊提取工藝，為其今后開發(fā)和利用提供基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配置真空脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、OPENLAB CDS工作站 （美國安捷倫公司）；TU-1901紫外-可見分光光度計(jì) （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；XS105DU電子分析天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q超純水機(jī) （美國Millipore公司）；XMTD-6000恒溫水浴鍋 （上海宜昌儀器紗篩廠）；TT6-5電熱鼓風(fēng)干燥箱 （上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；TGL-16G高速冷凍離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥 瓜蔞 （批號(hào)161101）、薤白 （批號(hào)161101）、清半夏 （批號(hào)161001）飲片均購自南陽仲景百信醫(yī)藥科技有限公司，經(jīng)課題組專家鑒定符合2015版 《中國藥典》各項(xiàng)要求。腺苷對(duì)照品 （西安舟鼎國生物技術(shù)有限公司，批號(hào)DH008-3）；鳥苷 （批號(hào) AJ0609NA14）、薯蕷皂苷 （批號(hào)P20J7F18116）對(duì)照品 （上海源葉生物科技有限公司）。甲醇為色譜純；磷酸、高氯酸、冰醋酸、無水乙醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 腺苷、鳥苷含有量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動(dòng)相甲醇（A） -0.05% 磷酸（B）， 梯度洗脫（0～10 min， 5% ～12%A； 10～15 min， 12% ～30%A）；檢測(cè)波長260 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫35℃；進(jìn)樣量20 μL。HPLC色譜圖見圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品腺苷10.30 mg、鳥苷10.33 mg，置于25 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1 各成分HPLC色譜圖

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取29份響應(yīng)面試驗(yàn)樣品溶液各10 mL，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)铀芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中定容，搖勻，12 000 r／min離心，上清液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液制備 以響應(yīng)面試驗(yàn)樣品提取溶劑為空白溶劑，按 “2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密量取適量腺苷、鳥苷對(duì)照品溶液混合，逐級(jí)稀釋，加水定容，制成分別含腺苷103.00、49.44、 20.60、 10.30、 2.06 μg／mL， 鳥苷 61.98、 24.79、12.40、 6.20、 1.24 μg／mL的溶液， 在 “2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X），峰面積為縱坐標(biāo) （Y）進(jìn)行回歸，得回歸方程分別為腺苷Y＝63.198X+6.697 9 （R2＝1）， 線性范圍2.06～103.00 μg／mL； 鳥苷Y＝49.374X-1.088 （R2＝1）， 線性范圍 1.24～61.98 μg／mL。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液適量，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得腺苷、鳥苷峰面積RSD分別為0.73%、0.87%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液20 μL，于0、2、4、8、12、24 h在 “2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得腺苷、鳥苷峰面積RSD分別為1.77%、1.51%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取6份供試品溶液，每份20 μL，在 “2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得腺苷、鳥苷含有量RSD分別為1.72%、1.17%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的供試品溶液6份，精密加入適量對(duì)照品，在 “2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，腺苷、鳥苷平均加樣回收率分別為96.31%、95.11%，RSD分別為1.97%、1.44%。

2.2 總皂苷含有量測(cè)定[12-13］

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品13.28 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

表1 因素水平

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取29份響應(yīng)面試驗(yàn)樣品溶液各10 mL，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)铀芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，再加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取5 mL，置于分液漏斗中，加10 mL水飽和正丁醇萃取3次，合并萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 最大吸收波長確定 精密吸取薯蕷皂苷對(duì)照品溶液0.4 mL，置于具塞試管中，80℃水浴揮干溶劑，加入5%香草醛試液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，70℃水浴加熱15 min，取出，冷卻至室溫，冰浴放置15 min后加4 mL冰醋酸，搖勻，采用紫外-可見分光光度計(jì)在400～700 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果，供試品、對(duì)照品溶液在540 nm波長處有最大吸收，而空白對(duì)照溶液在該處無吸收，故選擇其作為最大吸收波長。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于具塞刻度試管中，80℃水浴揮干溶劑，加入5%香草醛試液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，70℃水浴加熱15 min，取出，冷卻至室溫，冰浴放置15 min后加4 mL冰醋酸，搖勻；另精密量取0.4 mL甲醇同法操作，作為空白對(duì)照，在540 nm波長處測(cè)定吸光度 （A），以其對(duì)溶液質(zhì)量濃度 （X）進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.024 8X+0.002 7 （R2＝0.999 7）， 線性范圍 10.62～31.87 μg／mL。

2.3 干膏得率測(cè)定[14］精密吸取提取液10 mL，置于干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后105℃下干燥3 h以上，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量直至恒定，計(jì)算干膏得率。

2.4 工藝優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間 （B）、液料比 （C）、提取次數(shù) （D） 對(duì)腺苷、鳥苷、總皂苷提取量和干膏得率的影響，Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。因素水平見表1。

以腺苷、鳥苷、總皂苷提取量和干膏得率的總評(píng) “歸一值” （OD值） （Y） 為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過Hassan法[15］對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算公式為di＝ （Yi-Ymin）／（Ymax-Ymin），其中Yi為實(shí)測(cè)值，Ymax、Ymin分別為各指標(biāo)在不同試驗(yàn)中的最大值、 最小值； OD＝ （d1d2……dk）1／n， 其中 n為所選取的指標(biāo)數(shù)。結(jié)果見表2。

通過Design Expert 8.0.5.b軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到方程為Y＝-7.183 91+0.040 665A+0.799 53B+1.146 47C-0.214 21D+2.793 33×10-4AB-8.041 67×10-4AC+2.316 67×10-3AD-0.019 425BC+0.348 75BD+0.054 425CD-4.682 37×10-4A2-0.675 36B2-0.050 941C2-0.191 88D2，決定系數(shù)R2＝0.954 3，表明模型擬合度良好，OD值變化有95.43%來源于所選自變量。方差分析見表3。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析

由表可知，一次項(xiàng) （A、C、D）、交叉項(xiàng) （BD、CD）、平方項(xiàng) （A2、B2、C2、D2）均對(duì) OD值有顯著影響 （P＜0.05）；模型P＜0.000 1，表明模型極顯著；失擬項(xiàng) P＞0.05，表明方程在整個(gè)回歸區(qū)域擬合情況良好，可用于預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，響應(yīng)面分析見圖2，可知最優(yōu)提取工藝為12倍量43%乙醇提取2次，每次74 min。在此優(yōu)化工藝下進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得平均 OD值為 0.769 1（RSD＝1.18%）與預(yù)測(cè)值0.752 8相當(dāng)，表明模型穩(wěn)定性理想，工藝重復(fù)性良好。

圖2 各因素響應(yīng)面圖

3 討論與結(jié)論

中藥成分復(fù)雜，活性成分較多，對(duì)于多味藥材提取工藝而言，只有兼顧多指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)才能反映整體療效。由于多指標(biāo)評(píng)價(jià)采用打分制時(shí)存在一定主觀性，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行歸一化處理，以腺苷、鳥苷、總皂苷提取量和干膏得率的總評(píng) “歸一值” （OD值）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化瓜蔞薤白半夏膠囊提取工藝，能直觀地反映整體工藝。

結(jié)果表明，瓜蔞薤白半夏膠囊最優(yōu)提取工藝為12倍量43%乙醇提取2次，每次74 min，所得OD值與預(yù)測(cè)值相當(dāng)，表明該方法科學(xué)合理，工藝穩(wěn)定可靠，可為保證該制劑質(zhì)量水平和臨床療效提供依據(jù)。