9省市19個產(chǎn)地野馬追中2種活性成分測定及相關性分析

陳月桃， 呂偉旗， 潘晨曦， 鄒慧龍

（麗水市人民醫(yī)院藥學部，浙江麗水 323000）

野馬追系菊科多年生草本植物輪葉澤蘭Eupatorium lindleyanum DC.的地上部分，秋季花初開時采割，曬干入藥。其性平、味苦，歸肺經(jīng)，有清肺止咳、化痰平喘、降血壓的功效，臨床主要用于治療慢性支氣管炎、痰多、咳嗽、氣喘、高血壓等[1-2］?，F(xiàn)代藥物化學與藥理學研究表明，野馬追中含有萜類[3］、 黃酮類[4］、 甾體類[5］、 內(nèi)酯類[6］、有機酸[7］等化合物，具有抗炎、抗病毒、抑菌、保護肺損傷等多種藥理學活性[8-10］。

野馬追在我國分布較廣，除新疆外，其余各地均有分布，因南北跨度大，藥材質量參差不齊，影響其資源利用與市場健康發(fā)展[11］。藥材的產(chǎn)量和質量不僅受其自身遺傳特性的影響，而且也與多種環(huán)境因素密切相關，在藥材栽培實踐中了解生境因子與藥材質量和產(chǎn)量的相關性對提高藥材品質具有重要意義。醇溶性浸出物與金絲桃苷含有量是2015年版 《中國藥典》規(guī)定的野馬追主要質量評價指標。本研究收集9省市19個產(chǎn)地野馬追種質資源，對其醇溶性浸出物與金絲桃苷含有量進行考察，并分析其與生長性狀、產(chǎn)地生境因子間的相關性，以期為野馬追藥材質量評價與種質資源可持續(xù)利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑 Milli-Q Academic超純水儀 （美國Millipore公司）；DGG-9070電熱恒溫鼓風干燥器 （上海森信試驗儀器有限公司）；600-2998型高效液相色譜儀 （美國Waters公司）；FA2004G型電子分析天平 （上海花潮實業(yè)有限公司）；FQ-1024型超聲波清洗機 （杭州法蘭特超聲波科技有限公司）；HH-21-6型恒溫水浴鍋 （常州諾基儀器有限公司）；DF-300手提式粉碎機 （蘇州奇樂電子科技有限公司）；SHB-ⅢA循環(huán)水式真空泵 （北京林茂儀器有限公司）。金絲桃苷對照品 （YZ-111521）購于北京索萊寶科技有限公司；色譜級甲醇、乙腈購于北京京科瑞達科技有限公司；分析用甲醇、乙醇、醋酸、磷酸等試劑購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 材料 2017年9月至10月，收集遼寧、湖北、重慶、吉林、湖南、浙江、江蘇、山東、貴州9省市19個產(chǎn)地野馬追資源，經(jīng)麗水市人民醫(yī)院藥學部鄒慧龍副主任藥師鑒定為正品，信息見表1。

2 方法與結果

2.1 生長性狀考察 取新鮮野馬追植株，用卷尺測量株高，每株隨機取3片葉片，用直尺測量葉片中脈長 （葉長），葉寬，計算葉長寬比，用游標卡尺測量莖中部粗 （莖粗），每個產(chǎn)地隨機取20株。

2.2 醇溶性浸出物含有量測定 將新鮮野馬追藥材洗凈，取地上部分，切段，50℃下烘干至恒定質量，粉碎過60目篩。取藥材粉末2.0 g，加20 mL 60%乙醇，稱定質量，80℃水浴回流1 h，冷卻至室溫，乙醇補足減失質量，精密吸取10 mL提取液置于質量為a的蒸發(fā)皿中，105℃下烘干至恒定質量，取出置于干燥器中冷卻至室溫，稱定質量為b，計算醇溶性浸出物含有量。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.3 金絲桃苷含有量測定

2.3.1 色譜條件 Waters Xbridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-0.2%醋酸水；體積流量1.0 mL／min；檢測波長255 nm；柱溫26℃；進樣量10 μL。

2.3.2 線性關系考察 精密吸取質量濃度為0.109 mg／mL的金絲桃苷標準溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL置于10 mL量瓶中，甲醇定容。取適量，過 0.45μm 微孔濾膜，在“2.3.1”色譜條件下測定，以峰面積為縱坐標（Y），標準溶液質量濃度為橫坐標 （X），得回歸方程為Y＝13 819X-17.2，R2＝0.999 6，表明金絲桃苷在0.010 9～0.065 4 mg／mL的范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.3 樣品含有量測定 精密稱取樣品粉末1.0 g，加20 mL甲醇溶液，室溫條件下超聲 （功率250 W，頻率33 kHz）提取40 min，抽濾，定容至25 mL量瓶，取適量，過0.45 μm微孔濾膜，在 “2.3.1”色譜條件下測定，試驗平行3次，色譜圖見圖1。

圖1 金絲桃苷HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of hyperoside

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 隨機取S14樣品，按“2.3.3”項下方法制備樣品溶液，陰涼密閉放置0、 2、 4、 8、 12、 16、 24 h后， 在 “2.3.1” 項條件下進樣，測得S14樣品含有量RSD 1.07%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 精密度試驗 取同一對照品溶液，在“2.3.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，測得金絲桃苷平均峰面積RSD 0.93%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性試驗 隨機取S7樣品6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，測定樣品中金絲桃苷含有量，得S7樣品平均含有量 RSD 2.30%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 隨機取已知金絲桃苷含有量的S10樣品，按照低、中、高3個質量濃度加入適量金絲桃苷對照品，按 “2.3.3”項下方法制備供試品溶液，測定樣品中金絲桃苷含有量，計算加樣回收率，見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果 （n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝6）

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 用 SPSS23.0與EXCEL2010軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素ANOVA分析，聚類分析采用組間聯(lián)接法，區(qū)間測量采用歐式距離。

2.5 結果與分析

2.5.1 生長性狀、有效成分含有量測定 19個產(chǎn)地野馬追生長性狀、醇溶性浸出物、金絲桃苷含有量存在顯著性 （P＜0.05）或極顯著性 （P＜0.01）差異。生長性狀方面，江蘇種質野馬追表現(xiàn)優(yōu)良，其中句容樣品植株最高，平均株高1.32 m，金壇樣品莖粗、葉長、葉寬指標最高，分別為0.61、10.02、2.41cm；供試野馬追醇溶性浸出物平均含有量為13.34%，金絲桃苷平均含有量為0.696 9 mg／g，其中江蘇金壇醇溶性浸出物、浙江縉云金絲桃苷含有量最高，分別為17.94%、0.931 2 mg／g，湖北房縣樣品醇溶性浸出物、遼寧本溪金絲桃苷含有量最低，僅為9.12%、0.463 9 mg／g。樣品均符合2015年版 《中國藥典》 規(guī)定的標準[1］，見表3。

2.5.2 相關性分析 野馬追醇溶性浸出物、金絲桃苷含有量與生長性狀、產(chǎn)地生境因子間存在相關性，見表4。可知，醇溶性浸出物含有量與株高、莖粗、葉長、葉寬、葉長寬比、經(jīng)度呈正相關，其中與葉長呈最大正相關，相關系數(shù)為0.829 7；與緯度呈負相關，相關系數(shù)為0.434 4；與海拔相關性較低，相關系數(shù)僅為0.070 7；金絲桃苷含有量與株高、莖粗、葉長、葉寬、葉長寬比、經(jīng)度、海拔呈正相關，其中與葉寬呈最大正相關，相關系數(shù)為0.758 4；與緯度呈負相關，相關系數(shù)為0.484 7。表明，高海拔、高經(jīng)度、低緯度地區(qū)栽培野馬追有利于提高藥材中醇溶性浸出物與金絲桃苷含有量積累。

表3 不同產(chǎn)地樣品生長性狀與活性成分含有量比較Tab.3 Comparison of growth traits and active ingredient contents of samples in different growing areas

表4 活性成分含有量與生長性狀、生境因子相關性分析Tab.4 Correlation analysis between active ingredient contents and growth traits，habitat factors

2.5.3 聚類分析 根據(jù)歐式距離D2＝13.08可將供試19個產(chǎn)地野馬追劃分為3個類群，見圖2。第Ⅰ類群共6個產(chǎn)地，分別為浙江慶元、浙江臨安、浙江磐安、浙江縉云、江蘇句容、江蘇金壇。該類群以江浙野馬追為主，植株較高，莖稈粗壯，葉片大而多狹長，醇溶性浸出物含有量與金絲桃苷含有量較高；第Ⅱ類群共8個產(chǎn)地，分別為吉林通化、貴州臺江、貴州獨山、湖南藍山、湖南岳陽、吉林船營、山東招遠、重慶綦江。該類群以吉林、貴州與湖南產(chǎn)地為主，植株較矮，莖稈細，葉片較小而多寬鈍，醇溶性浸出物與金絲桃苷含有量較低；第Ⅲ類群共5個產(chǎn)地，分別為湖北神農(nóng)架、山東泰安、遼寧義縣、遼寧本溪、湖北房縣。該類群以湖北與遼寧產(chǎn)地為主，植株中等高度，莖稈中等粗度或較細，葉片較小而多狹長，醇溶性浸出物與金絲桃苷含有量較低。

圖2 19批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of nineteen batches of samples

3 討論

在2015年版 《中國藥典》與已有報道基礎上[1，12-13］， 本研究考察了不同流動相 （甲醇-水、乙腈-0.2%磷酸水、乙腈-0.2%醋酸水），提取方式（加熱回流提取、索式提取、超聲提取）與提取時間 （30、40、50、60 min）對野馬追中金絲桃苷含有量測定的影響，結果表明以甲醇為提取溶劑，在25℃下超聲提取 40 min，即可提取完全。在“2.3.1”項色譜條件下金絲桃苷出峰時間為7.963 min， 定量限為 2.58 μg／mL， 檢測限為1.12 μg／mL。

藥用植物在長期與環(huán)境因素，包括生物性因素與非生物性因素的適應過程中，其生長發(fā)育受自身遺傳與環(huán)境因素的雙重影響[14-15］。非生物性因素包括經(jīng)度、緯度、海拔、光照、水分等。本研究在收集野馬追藥材種質資源的基礎上，考察了其主要質量評價指標醇溶性浸出物、金絲桃苷含有量與生長性狀、生境因子之間的相關性，表明我國主分布區(qū)野馬追藥材質量較好，多樣性豐富，為野馬追良種選育提供了較好的備選種質；相關性結果表明在高經(jīng)度、高海拔、低緯度地區(qū)種植野馬追有利于其金絲桃苷含有量積累，野馬追良種選育可優(yōu)先在江蘇、浙江種質中選擇。

中藥材生長發(fā)育過程中，各環(huán)境因子間往往具有關聯(lián)性[16］，本研究下一步將在野馬追優(yōu)良種質資源篩選的基礎上，開展同一區(qū)域內(nèi)不同海拔對野馬追醇溶性浸出物與金絲桃苷成分含有量積累的影響分析，以減少經(jīng)度、緯度等環(huán)境因子與海拔因子間互作關聯(lián)性對藥材質量評價的影響。此外，本實驗收集的資源中，部分省市如重慶只收集到1個種質，區(qū)域代表性不強，其他分布區(qū)如云南、江西等地未收集到種質，后續(xù)工作將加強對上述產(chǎn)地野馬追藥材的收集與質量評價工作。