理氣散結(jié)顆粒對大鼠乳腺增生的影響

魏譚軍， 梁 源， 王 毅?， 王 張， 肖 成， 胡鳳嬌， 周殿儒， 孫位軍

（1.達州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川達州 635000；2.成都中醫(yī)藥大學，四川成都 611137）

乳腺增生是育齡婦女最常見的乳房疾病，其發(fā)病率居乳腺疾病首位，近年來明顯升高，多發(fā)于30～50歲婦女，癌變危險為健康婦女的1.4～1.5倍，癌變率為10%左右[1］。多發(fā)乳腺增生病可由不良刺激等因素導致女性內(nèi)分泌功能紊亂，雌激素、孕激素比例失衡，刺激乳腺組織過度增生引起[2］。目前西醫(yī)大多采用激素治療[3］，中醫(yī)認為，乳腺增生與肝腎沖任等脈有密切聯(lián)系，而且中藥在調(diào)節(jié)機體內(nèi)分泌治療乳腺增生療效顯著，已廣泛應(yīng)用[4-5］。

理氣散結(jié)顆粒由柴胡、香附、延胡索、甘草、青皮、蜂房、山慈菇、川芎、當歸、白芍組成，具有理氣調(diào)血、散結(jié)止痛的功效，主治肝郁血瘀、乳腺增生、乳癖結(jié)塊、乳癰初起、乳房脹痛。本實驗采用苯甲酸雌二醇和黃體酮誘導大鼠乳腺增生模型，探討理氣散結(jié)顆粒對該模型的影響。

1 材料

1.1 試藥 理氣散結(jié)顆粒 （批號151125）、理氣散結(jié)丸 （批號160812） （達州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院）；他莫昔芬 （上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批號160503）；小金丸 （九寨溝天然藥業(yè)集團有限責任公司，批號160114）；氯化鈉注射液 （四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號B16040811）；苯甲酸雌二醇注射液[6-10］（寧波第二激素廠，批號160623）；黃體酮注射液 （浙江仙琚制藥股份有限公司，批號151216）；水合氯醛 （成都市科龍化工試劑廠，批號20100614）；多聚甲醛 （國藥集團化學試劑有限公司，批號20161212、20160512）。大鼠E2ELISA試劑盒 （批號 XL-Er0478）、孕酮ELISA試劑盒 （批號 XL-Er0477）、雌激素受體（ER） （批號ab75635）、孕激素受體 （PR） （批號ab2765） （英國Abcam公司）。

1.2 儀器 電子天平 [賽多利斯科學儀器 （北京）有限公司］；低速離心機 （湘儀離心機儀器有限公司）；電子恒溫水浴鍋 （北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；全自動生化分析儀 （上海特康科技有限公司）；酶標儀 [賽默飛世爾科技 （中國）有限公司］；全玻璃注射器 （國營上海醫(yī)用激光儀器廠）；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機 （常州市中威電子儀器有限公司）；BMJ-Ⅲ型包埋機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀 （常州市中威電子儀器有限公司）。

1.3 動物 SPF級SD雌性大鼠96只，體質(zhì)量（200±20）g，購自成都達碩實驗動物有限公司，四川省實驗動物質(zhì)量合格證號51203500001212，許可證號SCXK （川）2015-030。

2 方法

2.1 分組 大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、他莫昔芬組 （0.003 3 g／kg）、小金丸組（0.200 0 g／kg）、 理氣散結(jié)丸組 （1.957 0 g／kg）及理氣散結(jié)顆粒低、中、高劑量組 （0.978 5、1.957 0、 3.914 0 g／kg）， 每組 12 只。

2.2 造模及給藥 空白對照組大鼠于后肢左右交替肌肉注射生理鹽水 （0.1 mL／只）；其余各組大鼠每天肌肉注射苯甲酸雌二醇0.000 5 g／kg，共25 d，再每天肌肉注射黃體酮 0.004 0 g／kg，共5 d[11］。理氣散結(jié)顆粒、他莫昔芬、小金丸臨用前用生理鹽水配成混懸液，于造模當天[11］灌胃給藥，每天1次，連續(xù)30 d；空白對照組和模型對照組大鼠灌胃生理鹽水，給藥量均為20 mL／kg。

2.3 血清E2、P水平測定 末次給藥后禁食不禁水24 h，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動脈采血5 mL，3 000 r／min離心10 min分離血清，取上清液，ELISA試劑盒按酶聯(lián)免疫吸附法，測定血清E2、P水平。

2.4 乳腺組織病理變化觀察 取各組大鼠第2對右側(cè)乳頭及其下乳房組織[12］，4%多聚甲醛溶液固定，全自動脫水機脫水，石蠟包埋，部分進行HE染色，光鏡下觀察乳腺組織增生程度，對乳腺小葉、腺泡等計數(shù)，描述小葉導管和腺泡的分泌、上皮增生脫落情況及腺泡結(jié)締組織，并按表1標準進行乳腺增生評級。

2.5 ER、PR蛋白表達檢測 應(yīng)用免疫組化法對大鼠乳腺組織中ER、PR蛋白進行陽性表達分析，在圖像分析系統(tǒng)中測定兩者光密度和面積。

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 17.0軟件進行處理，計量資料以s）表示，采用方差分析；等級資料采用非參數(shù)檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 乳腺組織病理變化 圖1、表2顯示，模型對照組大鼠乳腺組織中乳腺小葉和腺泡數(shù)量明顯增加，腺上皮細胞排列雖較正常，但有空泡變性（10／12）、 增生 （6／12）、 脫落 （2／12）、 壞死（2／12）表現(xiàn)，部分間質(zhì)因纖維組織增生而增寬，腺泡大小不等，管腔壁變??；與模型對照組比較，理氣散結(jié)顆粒低劑量組乳腺組織增生明顯改善（P＜0.05），具體表現(xiàn)為3／10的乳腺組織無增生，乳腺小葉和腺泡數(shù)量減少，腺上皮細胞空泡變性、增生、脫落變化減少，無壞死。

表1 大鼠乳腺增生評級Tab.1 Rating of rat mammary gland hyperplasia

圖1 各組大鼠乳腺組織病理形態(tài)變化 （HE，×400）Fig.1 Pathomorphological changes of rat mammary gland tissue in various groups（HE， ×400）

表2 各組大鼠乳腺組織病理切片等級Tab.2 Pathological section grades of rat mammary gland tissue in various groups

3.2 理氣散結(jié)顆粒對E2、P水平的影響 表3顯示，與模型對照組比較，理氣散結(jié)高劑量組大鼠E2水平顯著增加 （P＜0.05）；各劑量組P水平均無顯著變化 （P＞0.05），但中、高劑量組降低作用顯著強于理氣散結(jié)丸組 （P＜0.05）。

3.3 理氣散結(jié)顆粒對ER、PR蛋白表達的影響圖2～3、表4顯示，與模型對照組比較，理氣散結(jié)顆粒中、高劑量組ER蛋白表達顯著降低 （P＜0.05），同時高劑量組 PR蛋白表達也顯著降低（P＜0.01）。

表3 理氣散結(jié)顆粒對E2、P水平的影響 （Tab.3 Effects of Liqi Sanjie Granules on E2and P levels

表3 理氣散結(jié)顆粒對E2、P水平的影響 （Tab.3 Effects of Liqi Sanjie Granules on E2and P levels

注：與模型對照組比較，?P＜0.05；與理氣散結(jié)丸組比較，#P＜0.05

空白對照組 — 10 124.92±18.92 5.07±1.00模型對照組 — 12 113.26±22.00 4.18±0.87他莫昔芬組 0.003 3 9 142.17±30.19? 4.67±0.63小金丸組 0.200 0 11 132.23±15.35? 4.69±0.65理氣散結(jié)丸組 1.957 0 10 127.58±27.14 4.70±0.43理氣散結(jié)顆粒組 0.978 5 10 127.41±18.96 4.54±0.62理氣散結(jié)顆粒組 1.957 0 10 109.27±22.22 3.96±0.69#理氣散結(jié)顆粒組 3.914 0 11 132.81±23.62? 4.23±0.47#

圖2 各組大鼠乳腺組織ER蛋白表達 （IHC，×400）Fig.2 ER protein expressions of rat mammary gland tissue in various groups（IHC， ×400）

圖3 各組大鼠乳腺組織PR蛋白表達 （IHC，×400）Fig.3 PR protein expressions of rat mammary gland tissue in various groups（IHC， ×400）

表4 理氣散結(jié)顆粒對ER、PR蛋白表達的影響（Tab.4 Effects of Liqi Sanjie Granules on ER and PR protein expressions

表4 理氣散結(jié)顆粒對ER、PR蛋白表達的影響（Tab.4 Effects of Liqi Sanjie Granules on ER and PR protein expressions

注：與模型對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） 動物數(shù)／只 ER平均光密度 PR平均光密度空白對照組 — 10 0.229 0±0.006 5? 0.219 3±0.002 4??模型對照組 — 12 0.239 5±0.003 1 0.232 3±0.001 7他莫昔芬組 0.003 3 9 0.236 2±0.004 0 0.225 0±0.005 0小金丸組 0.200 0 11 0.235 0±0.002 6? 0.221 2±0.008 7?理氣散結(jié)丸組 1.957 0 10 0.235 0±0.002 7? 0.227 9±0.003 2?理氣散結(jié)顆粒組 0.978 5 10 0.237 6±0.003 0 0.226 6±0.010 9理氣散結(jié)顆粒組 1.957 0 10 0.235 0±0.002 0? 0.226 2±0.005 0理氣散結(jié)顆粒組 3.914 0 11 0.234 0±0.003 4? 0.221 1±0.005 9??

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為，雌激素、孕激素等性激素對乳腺發(fā)育及病理變化起著主導作用[13］。當體內(nèi)雌激素水平絕對或相對增加，孕激素水平絕對或相對減少時[14］，乳腺組織將受到雌激素長期刺激，導致乳腺導管和小葉增生，同時促進組織水、鈉潴留，進一步引起小葉間質(zhì)水腫[15］，并且乳腺實質(zhì)由于缺乏孕激素調(diào)節(jié)和保護而增生過度和復(fù)舊不全，從而引起乳腺導管上皮和纖維組織不同程度的增生和末梢腺管或腺泡形成囊腫，乳腺增生即是以這種增生和復(fù)舊的紊亂為基礎(chǔ)[16-17］。本實驗發(fā)現(xiàn)，各劑量理氣散結(jié)顆粒對大鼠血清雌二醇 （E2）水平的影響與理氣散結(jié)丸相當，但中、高劑量下降低孕酮（P）水平作用顯著強于后者。

研究顯示，雌激素受體 （ER）、孕激素受體（PR）過量表達可使乳腺增生、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展加劇，其中前者信號對乳腺生長、發(fā)育、細胞凋亡有調(diào)控效應(yīng)[8，18］。一般情況下，乳腺癌發(fā)展機制模式是 “正?！錾堑湫驮錾话櫺园盵19］，由此可知非典型增生是癌變過程中的必經(jīng)階段。 目前， 多數(shù)學者認為[20］Wnt-2、 C-myc、ER、PR等因子與乳腺癌生長、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)，同時乳腺腔分泌細胞的持續(xù)激活會導致乳腺癌發(fā)生[21］。有報道指出，乳腺是雌孕激素的靶器官，雌孕激素受體ER、PR能與雌孕激素特異性結(jié)合，乳腺增生發(fā)生與雌孕激素及雌孕激素受體紊亂有密切關(guān)系[22］。本實驗發(fā)現(xiàn)，中、高劑量理氣散結(jié)顆粒能顯著降低大鼠乳腺組織中ER蛋白表達，同時高劑量下還能顯著降低PR蛋白表達，與理氣散結(jié)丸作用相當。

從乳腺組織病理學來看，理氣散結(jié)顆粒對大鼠乳腺組織增生有明顯治療作用，具體表現(xiàn)為部分大鼠乳腺組織無乳腺增生，其余乳腺小葉和腺泡數(shù)量降低，腺上皮細胞空泡變性、增生、脫落減少，無壞死，與理氣散結(jié)丸作用相當。其中，低劑量下作用最明顯，其次為中、高劑量，其原因有待進一步研究。

理氣散結(jié)顆粒是由大蜜丸理氣散結(jié)丸改變劑型所得，與原劑型相比不僅有保存藥效、質(zhì)量穩(wěn)定、服用量小的優(yōu)點，而且能更好、更廣泛地應(yīng)用于臨床，市場規(guī)模大，前景良好。中醫(yī)認為，乳腺增生屬于 “乳癖”“乳中結(jié)核”范疇，理氣散結(jié)顆粒中柴胡疏肝解郁，為君藥；香附理氣疏肝，助柴胡疏肝解郁，與當歸、川芎、延胡索同用，增加其活血行氣止痛之功效，共為臣藥；青皮理氣化滯，白芍、甘草養(yǎng)血柔肝、緩急止痛，均為佐藥；蜂房、山慈姑消癰散結(jié)，與甘草調(diào)和諸藥同用，共為使藥，全方共奏疏肝解郁、活血行氣止痛之功效，從而治療乳癖。

綜上所述，理氣散結(jié)顆?？山档痛笫笕橄俳M織中ER、PR蛋白表達，減少與E2、P的特異性結(jié)合，從而緩解雌孕激素紊亂和乳腺增生，其機制可能與改善乳腺組織中ER、PR蛋白表達有關(guān)。