腹腔注射雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)免疫相關(guān)指標(biāo)及抗病力的影響

張紅霞，王 洋，楊 廣，曾祥茜，朱國(guó)霞，方珍珍，劉晉菘，張寶龍，吳 旋，白東清

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院/天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津渤海水產(chǎn)研究所，天津 300457；3.天津現(xiàn)代晨輝科技集團(tuán)有限公司，天津 301800；4.天津市靜海區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津靜海 301600）

雞血藤為豆科密花豆的干燥藤莖，是一味富含黃酮類化合物的中草藥，主要分布于廣東、廣西及云南等地區(qū)［1］。通過(guò)現(xiàn)代藥理學(xué)分析可知，雞血藤具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)脂代謝等作用［2-5］。雞血藤成分復(fù)雜，其醇提物的主要活性成分為黃酮。黃酮是一類化合物，普遍具有消除自由基、抑菌抗癌及調(diào)節(jié)脂代謝的活性［6］?？梢?jiàn)富含黃酮的雞血藤醇提物具有廣闊的應(yīng)用前景。

黃顙魚(yú)屬于鲇形目、鲿科、黃顙魚(yú)屬，廣泛分布于我國(guó)各大水系之中，是一類小型淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。黃顙魚(yú)魚(yú)肉氨基酸含量豐富，肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、無(wú)肌間刺，且具有滋補(bǔ)作用和藥用價(jià)值，得到消費(fèi)者普遍認(rèn)可，是目前國(guó)內(nèi)主要養(yǎng)殖魚(yú)類品種之一［7-8］。然而，近年來(lái)由于養(yǎng)殖密度增加，黃顙魚(yú)疾病頻發(fā)，發(fā)病池塘死亡率高，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，制約了黃顙魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展?；谏鲜鲈颍驹囼?yàn)通過(guò)腹腔注射方式探究雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)非特異性免疫能力與血脂水平的影響，為雞血藤醇提物作為黃顙魚(yú)飼料免疫增強(qiáng)劑提供前期數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

同一批次720尾健康全雄黃顙魚(yú)，購(gòu)自天津藍(lán)科水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。初始體質(zhì)量為（34.23±1.43）g，初始體長(zhǎng)為（14.12±0.28）cm。雞血藤醇提物粉末，購(gòu)自西安瑞林生物科技有限公司，使用前用無(wú)菌生理鹽水（0.85%）分別稀釋成60、120、240、480、960 mg/L。

飼料采用魚(yú)粉、豆粕、花生粕、豆油等原料配制，以上原料均購(gòu)自天津市天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司。配制的飼料營(yíng)養(yǎng)組成為：粗蛋白含量38.75%、粗脂肪含量6.23%、粗灰分含量10.13%、粗水分含量6.35%、鈣含量1.26%、磷含量1.90%。

嗜水氣單胞菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所贈(zèng)送。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及養(yǎng)殖管理 養(yǎng)殖試驗(yàn)在天津藍(lán)科水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司一棟700 m2孵化車間內(nèi)進(jìn)行，使用直徑1.5m，高度0.75 m的圓形孵化桶18個(gè)，將所選取的720尾黃顙魚(yú)隨機(jī)分為6組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)養(yǎng)殖40尾魚(yú)。其中1組注射生理鹽水1 mL標(biāo)記為Z1，為對(duì)照組，其余5組魚(yú)分別注射1 mL質(zhì)量濃度為60、120、240、480、960 mg/L的雞血藤醇提物溶液，依次標(biāo)記為Z2、Z3、Z4、Z5、Z6。注射后養(yǎng)殖7 d，每個(gè)平行隨機(jī)選取10尾魚(yú)取血解剖并取相應(yīng)組織，測(cè)定各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。每個(gè)平行取10尾魚(yú)繼續(xù)養(yǎng)殖，用于攻毒試驗(yàn)。養(yǎng)殖期間24 h連續(xù)增氧，每天于09：00、17：00進(jìn)行投餌，日換水量1/3。

1.2.2 血液及組織采集 養(yǎng)殖7 d后，首先取尾靜脈血，4 500 r/min離心15 min取上清液，制得血清樣品，于-80℃凍存待測(cè)。然后在冰浴條件下解剖，取鰓、腦、頭腎、中腎、肝胰臟、脾臟，用鑷子剔除掉結(jié)締組織和脂肪組織后用生理鹽水沖洗干凈，稱取組織0.4 g后加9倍體積的0.85%生理鹽水制成10%的勻漿液，然后在4℃4 000 r/min離心20 min，靜止5 min后，吸取上清液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，暫存于-80℃超低溫冰箱，用于測(cè)定生理生化指標(biāo)。

1.2.3 生理生化指標(biāo)的測(cè)定 超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、一氧化氮（NO）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、白蛋白（ALB）、補(bǔ)體C3、免疫球蛋白（IgM）活性均采用南京建成公司試劑盒，依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 攻毒致死率測(cè)定 選取注射不同濃度雞血藤醇提物的黃顙魚(yú)，每箱取10尾魚(yú)，每個(gè)處理30尾，按每100 g體質(zhì)量0.2 mL的比例腹腔注射嗜水氣單胞菌菌液（活化好的嗜水氣單胞菌，以無(wú)菌PBS緩沖液調(diào)濃度至2×108CFU/mL），繼續(xù)飼養(yǎng)7 d，每天定時(shí)記錄各組死亡尾數(shù)情況，試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算各組魚(yú)的累計(jì)死亡率和免疫保護(hù)率。

免疫保護(hù)率＝（1-N2/N1）×100%；

累計(jì)死亡率＝H2/H1×100%。

式中：N1為對(duì)照組死亡率，N2為試驗(yàn)組死亡率，H1為受感染魚(yú)尾數(shù)，H2為終死亡魚(yú)尾數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行One-ANOVA處理，以0.05作為差異性顯著水平，表格中試驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 腹腔注射雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)生理生化指標(biāo)的影響

2.1.1 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)SOD活性的影響 各組黃顙魚(yú)組織中SOD活性從高到低為中腎＞肝胰臟＞頭腎＞鰓＞血清＞脾臟＞腦。與對(duì)照組相比，注射雞血藤醇提物相同組織的SOD活力有所提高（表1）。頭腎、脾臟、鰓中SOD活力隨著雞血藤醇提物濃度的增加而上升（P＜0.05）。注射組黃顙魚(yú)腦中SOD活力均顯著高于Z1（P＜0.05），試驗(yàn)組之間變化不明顯（P＞0.05）。Z5和Z6組顯著提高了肝胰臟和中腎中SOD活力（P＜0.05）。其中Z6組中腎和肝胰臟酶活力分別是對(duì)照組的1.14倍和1.13倍（P＜0.05）。當(dāng)雞血藤醇提物質(zhì)量濃度增加至960 mg/L（Z6）時(shí)，血清SOD活力上升為對(duì)照組的1.06倍（P＜0.05）。

表1 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)SOD活性的影響

2.1.2 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)CAT活性的影響 由表2可知，對(duì)照組及各處理組黃顙魚(yú)體內(nèi)CAT活性均為腦中最高，其次為肝胰臟、鰓、中腎、頭腎和脾臟。除Z2組中腎和腦外，其余注射雞血藤醇提物組的各組織CAT活性均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。隨著雞血藤醇提物濃度的增加，黃顙魚(yú)肝胰臟、脾臟、中腎、頭腎和腦中CAT活性逐漸升高，并在Z6組達(dá)到最高值。Z6組肝胰臟CAT活性為（198.55±8.56）U/mg蛋白，是對(duì)照組的1.93倍（P＜0.05），脾臟CAT活性（7.53±0.91）U/mg蛋白，為對(duì)照組的1.75倍（P＜0.05），Z6組中腎、頭腎CAT活力分別上升至對(duì)照組的2.44倍和1.80倍（P＜0.05）。Z2～Z5組黃顙魚(yú)的鰓和血清中CAT活力均高于對(duì)照組，但各組間沒(méi)有顯著差異，同樣是在Z6組出現(xiàn)了最高值，CAT活性分別為（106.97±4.63）U/mg蛋白和（74.98±3.13）U/mg蛋白（P＜0.05）。

表2 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)CAT活性的影響

2.1.3 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)MDA含量的影響 由表3可知，注射雞血藤醇提物降低了各組織中MDA的含量，但降低效果在不同組織中略有不同。肝胰臟、鰓和血清中MDA含量隨雞血藤質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，并在Z6組降至最低，分別為（0.32±0.01）、（1.22±0.11）nmol/mg蛋白和（7.72±0.32）nmol/mL（P＜0.05）。但Z3組肝胰臟MDA含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。最低質(zhì)量濃度的雞血藤醇提物（Z2）對(duì)中腎和頭腎MDA含量沒(méi)有影響（P＞0.05），Z3～Z6組中腎和頭腎MDA含量隨著雞血藤質(zhì)量濃度的增加而降低。Z4～Z6雞血藤處理組脾臟的MDA含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。Z2、Z4和Z6組腦中MDA含量顯著低于對(duì)照組，其中Z6組含量最低，為（8.44±0.70）nmol/mg蛋白（P＜0.05）。而Z3、Z5組腦中MDA含量與對(duì)照組無(wú)差異（P＞0.05）。

表3 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)MDA含量的影響

2.1.4 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)GSH含量的影響 由表4可知，注射雞血藤醇提物提高了各組織中GSH的含量，中腎除Z5顯著降低外，其余各組與對(duì)照組無(wú)明顯差別，但提高效果在不同組織中略有不同。肝胰臟、脾臟、頭腎、腦、血清中GSH的含量隨著雞血藤濃度的增加，呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，并在Z6組升至最高，分別為（55.16±1.22）、（36.13±3.55）、（37.83±0.95）、（18.43±7.78）μmol/g蛋白和（321.05±17.73）μmol/mL（P＜0.05）。僅Z5和Z6處理組鰓的GSH含量較對(duì)照組有所提高，其中Z6組含量最高（P＜0.05），為（17.05±2.99）μmol/g蛋白，而低濃度組與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表4 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)GSH含量的影響

2.1.5 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)GSH-Px活性的影響由表5可知，注射雞血藤醇提物提高了各組織中GSH-Px的活性。肝胰臟、脾臟、頭腎、腦、血清中GSH-Px活性隨著雞血藤濃度的增加，呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，并在Z6組升至最高，分別為（140.64±21.16）、（23.89±0.17）、（139.44±4.79）、（16.63±3.28）μmol/g蛋白和（89.67±7.46）μmol/mL（P＜0.05）。而中腎在Z5組升至最高，為（54.29±2.21）μmol/g蛋白（P＜0.05）。高濃度雞血藤處理組（Z5～Z6）鰓的GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組，其中Z6組活性最高，為（18.36±1.28）μmol/g蛋白（P＜0.05），而低濃度組與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.1.6 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)NO含量的影響 如表6可知，各處理組黃顙魚(yú)體內(nèi)NO含量為鰓＞肝胰臟＞血清＞脾臟＞腦＞中腎＞頭腎。注射雞血藤醇提物對(duì)各組織及血清中NO含量的影響不同。血清中NO含量隨著雞血藤醇提物濃度的增加呈逐漸上升的趨勢(shì)，并在Z5和Z6組達(dá)到最高值，分別為（4.84±0.69）、（4.63±0.28）μmol/mL（P＜0.05）。而脾臟、頭腎、鰓、腦中NO含量隨著雞血藤醇提物濃度的增加而均呈逐漸下降的趨勢(shì)；Z4組脾臟與Z1組差異最為顯著，下降了30.3%（P＜0.05）；Z6組頭腎NO含量與對(duì)照組相比下降了55.6%（P＜0.05）；鰓和腦中NO含量均在Z4、Z5和Z6組中與Z1組相比顯著下降，而Z2、Z3組與對(duì)照組相當(dāng)（P＞0.05）。注射雞血藤醇提物對(duì)肝胰臟和中腎NO含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

表5 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)GSH-Px活性的影響

表6 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)體內(nèi)NO含量的影響

2.1.7 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)肝胰臟和血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響 各處理組黃顙魚(yú)體內(nèi)2種轉(zhuǎn)氨酶GOT和GPT的活性均為肝臟中較高，而血清中較低。與對(duì)照組相比，注射雞血藤醇提物的黃顙魚(yú)肝胰臟中GOT、GPT活性均隨著雞血藤濃度的上升而增加，在Z6組達(dá)到最高值，分別為（151.44±5.43）IU/g蛋白和（146.78±6.68）IU/g蛋白，為對(duì)照組的1.43倍和1.22倍（P＜0.05）。而血清中GOT、GPT活性均隨雞血藤濃度的增加而呈逐漸下降的趨勢(shì)，在Z6組降至最低。與對(duì)照組（Z1）相比，分別下降了39.6%和48.0%（P＜0.05）。血清中GOT/GPT的比值隨雞血藤醇濃度變化的規(guī)律不明顯，Z2和Z3組略高于對(duì)照組，而Z4和Z5組低于對(duì)照組，Z6組與對(duì)照組接近（P＞0.05）。

表7 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

2.1.8 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)血清其他免疫相關(guān)指標(biāo)的影響 由表8可知，注射雞血藤醇提物7 d后，黃顙魚(yú)血清中補(bǔ)體C3、白蛋白含量隨著雞血藤醇提物濃度的增加而逐漸上升，均在Z6組出現(xiàn)最大值，分別為（183.94±6.20）mg/L和（37.03±2.58）g/L，是對(duì)照組的3.12倍和1.74倍（P＜0.05）。注射雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)血清中球蛋白含量沒(méi)有顯著影響（P＞0.05）。

2.1.9 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)抗病力的影響 由表9可知，雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)抗病力的影響，注射雞血藤醇提物顯著降低了嗜水氣單胞菌攻毒黃顙魚(yú)的累計(jì)死亡率，提高了免疫保護(hù)率，且死亡率隨著雞血藤醇提物濃度的增加而下降。最高劑量組Z6組死亡率僅有（42.5±3.45）%，較對(duì)照組下降了34.6%（P＜0.05）。免疫保護(hù)率隨著雞血藤濃度的增加而上升，在Z6組達(dá)到最大值37.0%。

3 討論

生物細(xì)胞內(nèi)普遍含有SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶，可以清除細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，保護(hù)細(xì)胞生物大分子不受損傷，防止過(guò)氧化物MDA等的產(chǎn)生［9-10］。其中，SOD將氧自由基轉(zhuǎn)化為 H2O2，H2O2再被 CAT等轉(zhuǎn)化為H2O［11-12］。GSH-Px可以通過(guò)催化谷胱甘肽（GSH），將有毒的過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的羥基化合物，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和提高抗氧化能力的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射雞血藤醇提物后，黃顙魚(yú)血清及各組織中SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH、NO含量顯著提高，同時(shí)代表脂質(zhì)過(guò)氧化的MDA含量下降，表明雞血藤醇提物提高了黃顙魚(yú)的抗氧化能力［13］。這可能與雞血藤具有清除自由基和抗氧化的作用相吻合［14-15］。NO是細(xì)胞間傳遞信息的重要物質(zhì)之一，并且具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞免疫等功能［16-17］；機(jī)體在炎癥狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量NO，與超氧陰離子等氧自由基反應(yīng)，產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性［18-19］；本試驗(yàn)中雞血藤醇提物降低了脾臟、頭腎、鰓和腦中NO的含量，說(shuō)明雞血藤醇提物不會(huì)造成由NO引起的組織損傷。雞血藤醇提物小幅度提高了黃顙魚(yú)血清中NO含量，可能發(fā)揮積極的免疫調(diào)節(jié)作用。

表8 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)血清其他免疫指標(biāo)的影響

表9 雞血藤醇提物對(duì)黃顙魚(yú)抗病力的影響

腹腔注射雞血藤醇提物降低了黃顙魚(yú)肝胰臟及血清轉(zhuǎn)氨酶的活性，并且降低了GOT/GPT比值。GOT和GPT是氨基酸代謝過(guò)程中2個(gè)重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，是鑒定肝損傷的標(biāo)志性指標(biāo)。人類GOT/GPT比值越大時(shí)說(shuō)明肝損傷越發(fā)嚴(yán)重，GOT/GPT比值＞2時(shí)為酒精肝，比值＞1時(shí)為慢性乙肝。目前魚(yú)類GOT/GPT比值與其肝損傷程度的關(guān)系尚不明確，對(duì)照組GOT/GPT比值為1.87，注射雞血藤的Z6組為1.75，較對(duì)照組有所下降。若參考人類轉(zhuǎn)氨酶比值，說(shuō)明腹腔注射雞血藤醇提物可以降低肝損傷。雞血藤的護(hù)肝作用在哺乳動(dòng)物中也有報(bào)道［20］，但其作用機(jī)制還有待深入研究。

腹腔注射雞血藤醇提物增加了黃顙魚(yú)血清其他免疫指標(biāo)（補(bǔ)體C3、白蛋白）的水平，并且可以降低嗜水氣單胞菌攻毒后的累計(jì)死亡率，提高免疫保護(hù)率。魚(yú)類屬于低等脊椎動(dòng)物，其特異性免疫結(jié)構(gòu)尚不完善。補(bǔ)體C3、白蛋白和球蛋白（IgM）是魚(yú)體重要的免疫指標(biāo)，其中補(bǔ)體C3含量最多，在多種免疫調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵起始作用［21］。本試驗(yàn)中黃顙魚(yú)血清補(bǔ)體C3含量隨著注射雞血藤濃度的增加而逐漸上升。白蛋白是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，主要承擔(dān)著體內(nèi)貯存運(yùn)輸、維持血液膠體滲透壓、清除自由基等作用［22］。本試驗(yàn)中黃顙魚(yú)血清白蛋白呈逐漸上升的趨勢(shì)，并在Z6組達(dá)到最大值。IgM含量在魚(yú)類免疫球蛋白中含量最為豐富，注射雞血藤醇提物并未改變血清中球蛋白含量，可見(jiàn)雞血藤主要提高免疫相關(guān)指標(biāo)活性，從而提高黃顙魚(yú)的抗病力。

4 結(jié)論

腹腔注射雞血藤醇提物可有效提高黃顙魚(yú)免疫力以及抗病力，雞血藤醇提物濃度為960 mg/L效果最好。雞血藤醇提物有望作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于黃顙魚(yú)養(yǎng)殖中。