抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)灰巴蝸牛（Bradybaena ravida）的影響

方志翔，張 莉，沈文靜，郭汝清，劉 標(biāo)

（生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所/國(guó)家環(huán)境保護(hù)生物安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210042）

軟體動(dòng)物是動(dòng)物界中種類繁多的一個(gè)分支，已知種類有13萬(wàn)多種［1］。由于分布地域廣泛并且物種極其豐富，軟體動(dòng)物在全球陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)中都扮演了重要的角色。在指示生物和生物監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，軟體動(dòng)物可以被成功地用來(lái)獲取陸地、海洋和淡水生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境質(zhì)量信息［2］。就目前研究來(lái)看，軟體動(dòng)物中的腹足綱最多地應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)這一領(lǐng)域。腹足綱代表著唯一一類分布在陸地生態(tài)系統(tǒng)的軟體動(dòng)物。大部分陸棲腹足綱屬于肺亞螺綱，只有少數(shù)種類屬于前腮亞綱。蝸牛泛指腹足綱的陸生所有種類，生活于灌木叢、矮草叢、農(nóng)田及住宅附近陰暗潮濕地區(qū)，世界各地均有分布。在過(guò)去的20年間，人們對(duì)利用以蝸牛為代表的腹足綱土壤動(dòng)物進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)展現(xiàn)出越來(lái)越濃厚的興趣，并且開展了一系列卓有成效的研究［3-7］。

近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因植物在全球范圍內(nèi)種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，但是關(guān)于其生態(tài)環(huán)境安全性的爭(zhēng)議一直存在，大量的物種被用來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境生態(tài)安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)［8］。蝸牛作為一種食譜廣泛的植食性生物，很容易在自然條件下直接或間接食用或接觸轉(zhuǎn)基因植物。目前不論野生狀態(tài)下的蝸牛還是人工飼養(yǎng)條件下的蝸牛，其食物來(lái)源大多都是植物。另外，蝸牛一部分生活時(shí)間在植物根部土壤中，會(huì)接觸土壤。而目前有文獻(xiàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)基因作物的外源蛋白會(huì)隨著根系分泌物或者殘?bào)w降解而殘留于土壤中，并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間［9-11］。所以，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)蝸牛的影響，對(duì)于研究轉(zhuǎn)基因植物對(duì)非靶標(biāo)生物影響以及對(duì)自然生態(tài)環(huán)境影響是十分必要的。國(guó)外有學(xué)者研究過(guò)轉(zhuǎn)Bt基因作物對(duì)蝸牛的影響，也有使用純化Bt蛋白對(duì)蝸牛進(jìn)行毒理試驗(yàn)，但試驗(yàn)結(jié)論也是各執(zhí)一詞褒貶不一［12-16］。

本研究以在我國(guó)農(nóng)田廣泛存在的灰巴蝸牛（Bradybaena ravida）為研究對(duì)象，分別采取了棉葉直接喂飼法和人工飼料添加棉葉法在室內(nèi)進(jìn)行了灰巴蝸牛的飼養(yǎng)，研究了抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)其的影響。后一種方法避免了現(xiàn)有普通飼養(yǎng)方法易受季節(jié)影響，在秋冬季缺少植物鮮活組織從而影響試驗(yàn)，尤其是長(zhǎng)期試驗(yàn)進(jìn)行的弊端，為室內(nèi)長(zhǎng)期蝸牛飼養(yǎng)試驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用蝸牛于2017年6月采集自南京市六合區(qū)菜地中，共50只，經(jīng)鑒定為灰巴蝸牛。

抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花JA1由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，抗黃萎病基因Gbvdr2來(lái)源于海島棉品種海7124，親本棉花（CK）為陸地棉品種泗棉3號(hào)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 飼養(yǎng)條件 本研究于2017年6—10月在環(huán)境保護(hù)生物安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。將野外采集的蝸牛置于飼養(yǎng)盒中，底部鋪5～10 cm的人造土壤，其成分包括40%黃沙、20%泥炭土、40%高嶺土，混合均勻后采取濕熱滅菌法滅菌，冷卻后調(diào)節(jié)pH值為5～7，濕度40%左右，以紗布罩住盒口，置于人工氣候箱中，保持溫度在25～30℃，空氣相對(duì)濕度保持85%左右，光/暗周期12 h/12 h。投放無(wú)農(nóng)殘的有機(jī)青菜葉、空心菜葉預(yù)喂飼蝸牛備用。

1.2.2 飼養(yǎng)飼料 喂飼試驗(yàn)分為棉葉直接喂飼和人工飼料添加棉葉粉末喂飼2種。

1.2.2.1 棉葉 采集自抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花JA1及其親本泗棉3號(hào)，定期采集鮮嫩足量棉葉喂飼蝸牛。

1.2.2.2 人工飼料 人工飼料配方：每份人工飼料包括玉米粉100 g、大豆粉100 g、小麥粉100 g、酵母粉50 g、磷酸氫鈣30 g、蔗糖20 g、復(fù)合維生素（煙酰胺1.0 g、硫胺素0.25 g、核黃素0.50 g、吡哆素0.25 g、鈷胺素0.02 g、葉酸0.25 g、泛酸鈣1.0 g、生物素0.02 g），體積分?jǐn)?shù)40%的甲醛1 mL，加水600 mL。攪拌混勻后濕熱滅菌，冷卻凝固后切成片狀置于小的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置入土里，略微露出邊沿。

按照試驗(yàn)需要，在上述人工飼料中添加不同劑量的經(jīng)超低溫冷凍研磨粉碎后的轉(zhuǎn)基因植物組織粉末，對(duì)照組添加親本植物組織粉末，喂飼蝸牛。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蝸牛短期喂飼棉葉死亡率試驗(yàn) 以抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花JA1及其親本棉花幼嫩莖葉喂飼蝸牛，陽(yáng)性對(duì)照組喂飼涂抹四聚乙醛的菜葉（1 g/g菜葉），每組設(shè)3只貝殼螺旋數(shù)接近、大小質(zhì)量近似的蝸牛，持續(xù)喂飼72 h，分別在24、48、72 h監(jiān)測(cè)蝸牛的死亡率。

1.3.2 蝸牛取食率試驗(yàn) 測(cè)定蝸牛取食棉葉的效率，挑選貝殼螺旋數(shù)接近、大小質(zhì)量近似的單只蝸牛放入培養(yǎng)瓶，將不同的棉花葉片打成直徑3 cm的圓片，每個(gè)培養(yǎng)瓶中放置1種棉花葉片1張，2組處理各設(shè)3次重復(fù)，記錄24 h內(nèi)的取食率。

1.3.3 蝸牛短期喂飼人工飼料試驗(yàn) 以抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花JA1及其親本棉花莖葉經(jīng)超低溫冷凍研磨后加入飼料喂飼蝸牛，1 kg飼料中混入棉花莖葉組織細(xì)粉100 g和200 g，陽(yáng)性對(duì)照組喂飼加入四聚乙醛的飼料。每組設(shè)3只螺旋數(shù)一致、大小質(zhì)量接近的蝸牛，持續(xù)喂飼72 h，分別在24、48、72 h監(jiān)測(cè)蝸牛的死亡率。

1.3.4 蝸牛長(zhǎng)期喂飼人工飼料試驗(yàn) 以抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花JA1及其親本棉花喂飼蝸牛，1 kg飼料中混入棉花莖葉組織細(xì)粉200 g，每組設(shè)3只質(zhì)量接近的幼貝（3螺層），分別稱量其體質(zhì)量并記錄，持續(xù)喂飼70 d，期間每14 d監(jiān)測(cè)1次體質(zhì)量。

1.3.5 蝸牛人工飼料取食率試驗(yàn) 以抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花JA1及其親本棉花喂飼蝸牛，1 kg飼料中混入棉花莖葉組織細(xì)粉200 g，每組設(shè)3只螺層、質(zhì)量接近的成貝（5螺層以上）作為重復(fù)，每次喂飼前后對(duì)飼料進(jìn)行稱量，計(jì)算24 h內(nèi)蝸牛的取食量。

1.3.6 蝸牛SOD酶活4號(hào)測(cè)定 在棉葉短期喂飼試驗(yàn)結(jié)束后，取蝸牛去殼勻漿，使用SOD酶檢測(cè)試劑盒（南京建成生物公司）檢測(cè)其體內(nèi)SOD酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用MS Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和作圖，用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析Oneway ANOVA和最小顯著差異法（LSD，α＝0.05）比較不同處理間差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝸牛短期喂飼葉片死亡率

喂飼不同棉花葉片后的72 h內(nèi)，不同處理組的死亡率情況見表1。從表1可以看出，在試驗(yàn)開始的24、48、72 h內(nèi)，喂飼棉花轉(zhuǎn)基因棉花和親本棉花葉片的蝸牛均未出現(xiàn)死亡情況，而喂飼涂抹四聚乙醛棉葉的蝸牛則全部死亡。

2.2 蝸牛葉片取食率

喂飼不同棉花葉片24 h后，不同處理組的取食率見表2。從表2可以看出，喂飼親本棉花葉片的蝸牛取食率達(dá)53.18%，而喂飼轉(zhuǎn)基因棉花JA1葉片的蝸牛取食率為52.13%，二者對(duì)棉花葉片的取食率沒有顯著性差異。

表1 蝸牛喂飼葉片急性死亡率

表2 蝸牛葉片取食率

2.3 蝸牛短期喂飼人工飼料死亡率

以人工飼料添加棉花莖葉組織粉末喂飼蝸牛，不同時(shí)段蝸牛死亡率見表3。添加棉花莖葉組的蝸牛不論轉(zhuǎn)基因組還是親本組，高劑量組還是低劑量組，在72 h內(nèi)均未出現(xiàn)死亡情況，喂飼添加四聚乙醛人工飼料組的蝸牛則全部死亡。

表3 蝸牛喂飼人工飼料急性死亡率

2.4 蝸牛長(zhǎng)期喂飼人工飼料試驗(yàn)

蝸牛長(zhǎng)期喂飼人工飼料體質(zhì)量變化情況見圖1。在喂飼轉(zhuǎn)基因棉花及其親本棉花葉片飼料的0、14、28、42、56、70 d分別測(cè)定蝸牛的體質(zhì)量，在轉(zhuǎn)基因棉花和親本棉花處理組之間，其體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)一致，同一時(shí)間內(nèi)，不同處理組間差異不顯著。

2.5 蝸牛喂飼人工飼料取食量測(cè)定

使用添加轉(zhuǎn)基因棉花及其親本棉花粉末的人工飼料喂飼蝸牛，24 h內(nèi)的蝸牛取食量結(jié)果見圖2，在不同處理組之間，取食量并沒有顯著性差異。

2.6 蝸牛SOD酶活測(cè)定

在棉葉短期喂飼試驗(yàn)（72 h）結(jié)束后，檢測(cè)了蝸牛SOD酶活性，結(jié)果見圖3。在喂飼轉(zhuǎn)基因棉花及其親本棉花葉片的蝸牛之間，其體內(nèi)SOD酶活沒有顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

蝸牛是農(nóng)業(yè)上的一種害蟲，覓食范圍非常廣泛，可危害豆科、十字花科和茄科蔬菜，以及棉、麻、甘薯、禾谷類作物，桑樹、果樹等樹木；農(nóng)地中的蝸牛食用農(nóng)作物的葉、莖、芽、花和多汁的果實(shí)，可造成葉片穿透狀孔洞、斷苗、傷殘果等，并傳播作物病害，危害蔬菜、花卉、中藥材、果樹等多種農(nóng)作物。另外，部分蝸牛品種因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，或者外型適合觀賞而被大量人工養(yǎng)殖帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。目前，我國(guó)棉田野生蝸牛品種以灰巴蝸牛與同型巴蝸牛為主?；野臀伵?，柄眼目，巴蝸?？?，廣泛分布在我國(guó)東北、華北、華東、華南、華中、西南、西北等地區(qū)。寄生于黃麻、紅麻、苧麻、棉花、豆類、玉米、大麥、小麥、蔬菜、瓜類等危害莖葉造成缺刻，嚴(yán)重時(shí)咬斷嫩苗，造成缺苗斷壟［17-20］。因此，以灰巴蝸牛為代表性研究對(duì)象，對(duì)于探索轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)蝸牛的影響有著現(xiàn)實(shí)的意義。筆者在野外采集灰巴蝸牛，在實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行了人工飼養(yǎng)，用于試驗(yàn)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，直接喂飼轉(zhuǎn)基因棉花葉片的蝸牛與喂飼親本棉花葉片的蝸牛相比，在進(jìn)行72 h喂飼后，沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，并且，二者對(duì)棉葉的取食率也沒有顯著性差異。表明轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)蝸牛并沒有急性毒性效應(yīng)。另外，為了保證長(zhǎng)期飼養(yǎng)試驗(yàn)的進(jìn)行，筆者還研發(fā)了人工飼料添加棉花葉片粉末喂飼蝸牛的新方法，該方法保證了在非棉花生長(zhǎng)期對(duì)蝸牛的長(zhǎng)期飼養(yǎng)。人工飼料喂飼試驗(yàn)結(jié)果表明，72 h內(nèi)，喂飼轉(zhuǎn)基因棉花人工飼料的和親本棉花人工飼料的處理組均未出現(xiàn)蝸牛死亡現(xiàn)象。喂飼70 d的長(zhǎng)期試驗(yàn)結(jié)果表明，不同處理組之間蝸牛體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)一致，相同時(shí)期沒有顯著性差異。單貝取食人工飼料的質(zhì)量，在不同處理組間也沒有顯著性差異。72 h喂飼試驗(yàn)結(jié)束后，檢測(cè)了蝸牛體內(nèi)的SOD酶活性，轉(zhuǎn)基因棉花組與親本棉花組之間沒有顯著性差異。

近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因植物在世界上的種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，但爭(zhēng)議一直存在。我國(guó)政府保持著積極研發(fā)、慎重推廣的態(tài)度，這就要求我們的轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評(píng)價(jià)工作一定要全面、長(zhǎng)期、深入開展。本研究以我國(guó)種植面積最大的轉(zhuǎn)基因植物棉花為評(píng)價(jià)目標(biāo)，以數(shù)量龐大的軟體動(dòng)物門代表性動(dòng)物蝸牛為研究對(duì)象，進(jìn)行了安全評(píng)價(jià)工作，為轉(zhuǎn)基因棉花的環(huán)境安全評(píng)價(jià)增添了新數(shù)據(jù)。