優(yōu)化18F-FHBG自動(dòng)化合成方法及其質(zhì)量評(píng)估

，，，，*

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450052；2.河南省分子影像醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052)

核素報(bào)告基因顯像是監(jiān)測(cè)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)、外源性基因表達(dá)最具潛力的方法之一，其中最關(guān)鍵點(diǎn)是報(bào)告基因和放射性藥物(報(bào)告探針)的選擇。單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV1-tk基因)是最常用的報(bào)告基因之一[1]，而18F-FHBG為檢測(cè)HSV1-tk基因表達(dá)最具特異性的顯像劑之一[2]。18F-FHBG的主要優(yōu)點(diǎn)是在HSV1-tk非表達(dá)細(xì)胞中濃聚較少，而在靶器官表達(dá)顯著；但其制備過程復(fù)雜，且產(chǎn)率較低。為減少合成時(shí)間，提高18F-FHBG產(chǎn)率，本研究對(duì)洗脫方法和純化方法進(jìn)行改進(jìn)，用全自動(dòng)合成一鍋法[3-4]和SEP-PAK C18[5]小柱固相萃取法合成正電子示蹤劑18F-FHBG；并對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量鑒定，分析純化后的產(chǎn)物在健康昆明小鼠體內(nèi)的生物分布，并觀察其在健康新西蘭大白兔體內(nèi)的PET/CT顯像特征，評(píng)估采用改進(jìn)方法合成的18F-FHBG的質(zhì)量穩(wěn)定性，為下一步高效合成18F-FHBG進(jìn)行HSV1-tk/18F-FHBG核素報(bào)告基因顯像研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 隨機(jī)選取健康昆明小鼠20只[合格證號(hào)SCXK(豫)2017-0004]，雄性，6～8周，體質(zhì)量25.5～30.5 g，平均(28.00±2.50)g，用于觀察18F-FHBG生物學(xué)分布；選取健康新西蘭大白兔4只[合格證號(hào)SCXK(豫)2017-0008]，雄性，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，平均(2.50±0.50)kg，用于觀察18F-FHBG PET/CT顯像特征；均購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)通過鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑 美國藥典級(jí)乙醇(US pharmacopoeia，USP Milliper公司)；前體N2-(對(duì)甲氧苯基二苯基甲基)-9-[(4-甲苯磺?；?-3-對(duì)甲氧苯基二苯基甲氧基-甲基丁基]鳥嘌呤；HCl、NaOH、Buffer(北京化學(xué)試劑廠)；H218O(豐度97%)以及無水乙腈等。

1.3 儀器 醫(yī)用回旋加速器(Sumitomo HM-20S)；多功能模塊(住友CFN-multi-p100)；CFN-multi-P100(配備Allrtech 626雙泵和UVSI 200全波長紫外檢測(cè)器，Grace Alltima C18 HPLC柱)；Sep-Pak C18及QMA柱(Waters公司)；IC-H柱(Alltech公司)；PET/CT成像系統(tǒng)(Siemens Biography True Point 64 52環(huán))；Syngo工作站(Siemens True D融合軟件)。

1.4 合成方法 采用住友合成模塊合成18F-FHBG，自行設(shè)計(jì)流程。合成反應(yīng)開始前，將所有試劑加于預(yù)先設(shè)計(jì)的相應(yīng)位置，用回旋加速器加速質(zhì)子轟擊 H218O，經(jīng)18O(p，n)反應(yīng)生成18F-；18F-在He氣的作用下通過SEP-PAK QMA陰離子小柱并被QMA柱捕獲，在真空泵的作用下將0.7 ml kryptofix2.2.2和0.2 ml碳酸鉀混合溶液倒吸通過QMA柱，將18F-洗脫注入反應(yīng)瓶。為保證加入前體前是絕對(duì)無水環(huán)境，將反應(yīng)瓶加熱至120℃，持續(xù)6～8 min，隨后加入1.0 ml乙腈溶液，加熱至100℃，持續(xù)5 min，完成2次除水。

將0.75 ml前體N2-(對(duì)甲氧苯基二苯基甲基)-9-[4-甲苯磺?；鵠-3-對(duì)甲氧苯基二苯基甲氧基-甲基丁基]鳥嘌呤溶液加入反應(yīng)瓶，加熱至120℃，反應(yīng)持續(xù)8 min，此過程中前體與18F-發(fā)生親核取代反應(yīng)，完成后冷卻濃縮反應(yīng)液。將0.75 ml鹽酸溶液加入到反應(yīng)瓶中，加熱至95℃，持續(xù)5 min，完成水解反應(yīng)，此時(shí)混合液pH值為酸性且含有雜質(zhì)，需進(jìn)一步中和及純化。加入0.5 ml NaOH和1.0 ml磷酸二氫鈉緩沖液(Buffer)混合液于反應(yīng)瓶中，中和產(chǎn)物混合液，產(chǎn)物混合液通過SEP-PAK C18小柱時(shí)可吸附于小柱上。以預(yù)先備好的乙醇通過C18小柱洗脫產(chǎn)物，于產(chǎn)物瓶中注入生理鹽水稀釋18F-FHBG，經(jīng)無菌濾膜濾過備用，制成注射液。

1.5 放射化學(xué)純度和體外穩(wěn)定性檢測(cè) 采用HPLC法測(cè)定18F-FHBG注射液的化學(xué)純度和放射化學(xué)純度。HPLC分析條件：C18分析柱，流動(dòng)相為 3 mmol/L NaH2PO4的10%乙醇溶液，流速為1 ml/min，紫外(UV)檢測(cè)波長為254 nm[5]。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.6.1 生物分布實(shí)驗(yàn) 將20只健康昆明小鼠隨機(jī)分成4組，每組5只。經(jīng)尾靜脈注射放射性藥物18F-FHBG注射液(5.55 MBq)約0.1 ml，分別在給藥后5、30、60、120 min采用斷脊法處死小鼠，取心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、胃、小腸、股骨、肌肉、腦和血液樣本分別置于試管中，以天平稱重，并用井型γ探測(cè)器測(cè)其放射性計(jì)數(shù)，經(jīng)衰減校正后，計(jì)算單位組織攝取率(每克組織占注射劑量的百分比，單位%ID/g)。

1.6.2 活體PET/CT顯像 對(duì)4只新西蘭大白兔經(jīng)肌肉注射2%戊巴比妥鈉1 ml/kg體質(zhì)量[6]，待其進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)后，經(jīng)耳緣靜脈注入0.2 ml18F-FHBG注射液(11.1～14.8 MBq/kg體質(zhì)量)，分別在給藥后10、30、60、90、120 min進(jìn)行PET/CT掃描，3分鐘/床位，經(jīng)Syngo工作站處理獲得PET/CT圖像。

表1 正常昆明小鼠不同部位生物分布結(jié)果(%ID/g，±s)

表1 正常昆明小鼠不同部位生物分布結(jié)果(%ID/g，±s)

部位放射性攝取率5 min30 min60 min120 min心臟0.033±0.0090.022±0.0070.020±0.0070.015±0.002肺臟0.057±0.0090.049±0.0040.047±0.0080.034±0.005肝臟0.074±0.0080.070±0.0040.049±0.0060.017±0.004脾臟0.059±0.0080.048±0.0050.036±0.0040.016±0.002腎臟0.271±0.0030.370±0.0090.490±0.0040.460±0.003胃0.062±0.0020.064±0.0040.070±0.0020.046±0.009小腸0.052±0.0080.086±0.0060.167±0.0110.157±0.018股骨0.019±0.0020.018±0.0050.017±0.0040.002±0.002肌肉0.020±0.0030.019±0.0040.002±0.0010.002±0.002腦0.019±0.0020.017±0.0030.016±0.0020.015±0.003血液0.243±0.0800.050±0.0220.006±0.0030.004±0.002

圖1 18F-FHBG的HPLC質(zhì)量控制圖譜 A.紫外峰，UA=254 nm； B.放射峰，tR=2.5 min

2 結(jié)果

2.118F-FHBG合成及質(zhì)量控制指標(biāo)18F-FHBG自動(dòng)化合成時(shí)間為19～25 min。獲得的18F-FHBG產(chǎn)品為無色溶液，pH≈7.0，放射性濃度>70 MBq/ml。18F-FHBG未校正的合成效率為(19.00±5.00)%(n>10)。產(chǎn)品經(jīng)放射層析圖譜分析，結(jié)果呈現(xiàn)單峰，與標(biāo)準(zhǔn)品19F-FHBG保留時(shí)間(retention time, tR)一致，均為tR=2.5 min；經(jīng)紫外層析圖譜分析，只發(fā)現(xiàn)溶劑峰，未發(fā)現(xiàn)前體峰，即HPLC法測(cè)定注射液中18F-FHBG的放射化學(xué)純度>99%。見圖1。

2.218F-FHBG的體外穩(wěn)定性檢測(cè) 將18F-FHBG產(chǎn)品在生理鹽水和血清中稀釋，測(cè)定正電子示蹤劑的穩(wěn)定性。采用生理鹽水稀釋18F-FHBG產(chǎn)品，室溫放置5、30、60、90、120 min及6 h后其放射化學(xué)純度分別為(98.31±0.64)%、(98.08±0.83)%、(97.40±0.69)%、(97.21±0.53)%、(97.23±0.52)%及(97.24±0.61)%；采用血清稀釋18F-FHBG，室溫放置5、30、60、90、120 min及6 h后其放射化學(xué)純度分別為(98.07±0.68)%、(98.02±0.82)%、(97.33±0.59)%、(97.12±0.51)%、(97.13±0.54)%及(96.96±0.62)%。在生理鹽水和血清中，6 h內(nèi)18F-FHBG放射化學(xué)純度均未明顯減低，可滿足進(jìn)一步研究需要。

2.3 生物分布結(jié)果 在小鼠血液中，注射18F-FHBG 5 min時(shí)攝取率最高，為(0.243±0.080)%ID/g，之后快速下降，30 min時(shí)下降至(0.050±0.022)%ID/g，120 min時(shí)接近本底水平。在小鼠心臟、肝臟、肺臟和脾臟中，注射18F-FHBG 5 min時(shí)攝取率最高，隨時(shí)間延長而逐漸降低，120 min下降至觀察時(shí)間的最低值。在小鼠胃和小腸中，注射18F-FHBG 60 min時(shí)攝取率最高，之后逐漸下降。在小鼠腎臟中，注射18F-FHBG 60 min時(shí)攝取率最高。小鼠股骨和肌肉對(duì)18F-FHBG的攝取率較低。小鼠腦組織對(duì)18F-FHBG的攝取率也較低，且在120 min內(nèi)無明顯變化。見表1。

2.4 活體PET/CT顯像結(jié)果 新西蘭大白兔PET/CT結(jié)果表明，注射18F-FHBG 10、30、60、90及120 min時(shí)，放射性分布較高的分別為膀胱、腎臟、腸道及肝膽。圖2為注射18F-FHBG 10 min時(shí)，放射性分布已遍及兔全身，肝膽、腎臟及腸道已開始顯像；與其他顯像時(shí)間相比，注射18F-FHBG 10 min時(shí)腎臟顯像最明顯，此后隨時(shí)間延長其代謝逐漸減弱。圖3為注射18F-FHBG 30 min時(shí)，腎臟顯像已逐漸減少，腸道及肝膽顯像逐漸增強(qiáng)；圖4為注射18F-FHBG 60 min時(shí)，腎臟顯像更弱，空腸、回腸顯像逐漸減弱，而盲腸、乙狀結(jié)腸顯像逐漸增加。圖5為注射18F-FHBG 90 min時(shí)，腎臟已幾乎不顯像，空腸、回腸顯像減弱更加明顯，盲腸顯像逐漸增強(qiáng)。圖6為注射18F-FHBG 120 min時(shí)，盲腸顯像最明顯，其他器官幾乎不顯像。在整個(gè)放射性顯像過程中，由于血液清除速率快，使顯像過程中本底較低，其他器官顯像明顯，對(duì)比效果較好。

3 討論

18F-FHBG的合成方法包括一鍋法[5，7]和二鍋法[8-9]，一鍋法是在同一反應(yīng)瓶中完成親核、水解、中和三步反應(yīng)；二鍋法是將相應(yīng)的反應(yīng)分步完成，然后將生成的中間體轉(zhuǎn)移到同一反應(yīng)瓶中進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。目前較少采用二鍋合成法合成18F-FHBG。Shiue等[5]采用手動(dòng)一鍋法合成18F-FHBG，所得產(chǎn)物產(chǎn)率較高，且放射化學(xué)純度>97%，但手動(dòng)合成會(huì)導(dǎo)致操作者輻射劑量增多，分裝放射性藥物時(shí)，手部是全身受輻射劑量最高部位[10]。有學(xué)者[9]提出全自動(dòng)一鍋合成法。本研究采用全自動(dòng)合成模塊合成18F-FHBG，不僅可減少操作者輻射劑量，而且合成效率高，可重復(fù)性強(qiáng)。

為減少反應(yīng)時(shí)間、增加18F-FHBG產(chǎn)率，本研究主要對(duì)2個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)：①產(chǎn)物洗脫液；②采用純化方法。傳統(tǒng)洗脫液包含二氯甲烷、0.1%三乙胺和5%～10%乙醇；洗脫產(chǎn)物后，需分洗脫液與產(chǎn)物。有學(xué)者[11]采用傳統(tǒng)洗脫液洗脫產(chǎn)物，合成時(shí)間相對(duì)較長。本研究采用乙醇代替?zhèn)鹘y(tǒng)洗脫液，產(chǎn)物18F-FHBG吸附在SEP-PAK C18小柱后，直接用乙醇將18F-FHBG從小柱中洗脫，不需蒸發(fā)乙醇溶劑，溶液經(jīng)生理鹽水稀釋后獲得18F-FHBG混合液，可直接用于后續(xù)動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)物18F-FHBG混合液的純化方法包括HPLC[6,8]和SEP-PAK C18[8,12]固相萃取方法。有學(xué)者[6]同時(shí)采用上述2種純化方法，對(duì)比發(fā)現(xiàn)采用SEP-PAK C18固相萃取方法獲得的產(chǎn)物產(chǎn)率高于HPLC純化法，合成時(shí)間自90 min縮短至60 min。本研究采用SEP-PAK C18固相萃取法純化產(chǎn)物，操作簡單，純化過程時(shí)間短，合成效率明顯提升，產(chǎn)品合成時(shí)間為23～26 min，未校正的合成效率為(19.00±5.00)%。

圖2 注射18F-FHBG 10 min時(shí)正常新西蘭大白兔全身顯像 A～F.放射性分布已遍及全身，肝膽、腎臟、腸道已開始顯像 圖3 注射18F-FHBG 30 min時(shí)正常新西蘭大白兔全身顯像情況 A～F.腎臟顯像已逐漸減少，腸道及肝膽顯像逐漸增強(qiáng) 圖4 注射18F-FHBG 60 min時(shí)正常新西蘭大白兔全身顯像情況 A～F.腎臟顯像更弱，空腸、回腸顯像逐漸減弱，而盲腸、乙狀結(jié)腸顯像逐漸增加

圖5 注射18F-FHBG 90 min時(shí)正常新西蘭大白兔全身顯像情況 A～F.腎臟已幾乎不顯影，空腸、回腸顯影也更弱，盲腸顯影逐漸增強(qiáng) 圖6 注射18F-FHBG 120 min時(shí)正常新西蘭大白兔全身顯像情況 A～F.盲腸顯影最明顯，其他器官幾乎不顯影

本研究中18F-FHBG在正常昆明小鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布結(jié)果及新西蘭大白兔全身PET/CT顯像結(jié)果與既往研究[12]結(jié)果一致。對(duì)動(dòng)物注射18F-FHBG混合液后，18F-FHBG在血液中的清除速率較快，顯像時(shí)可增加圖像對(duì)比度。骨骼、肌肉對(duì)18F-FHBG攝取較少，且隨時(shí)間延遲攝取率逐漸降低，提示后期顯像研究中本底較低，靶/非靶的比值增加，有利于觀察病灶。18F-FHBG在小鼠腎臟內(nèi)分布最多，表明藥物主要經(jīng)過泌尿系統(tǒng)排泄，推測(cè)該示蹤劑用于泌尿系統(tǒng)研究時(shí)可受到一定程度的影響。胃腸道是18F-FHBG體內(nèi)排泄的另一途徑。18F-FHBG在小鼠腦組織中的攝取率極少，且隨時(shí)間變化改變較小，提示18F-FHBG可能無法通過血腦屏障，用于觀察血腦屏障破壞的疾病時(shí)對(duì)比效果可能較好。