H5亞型禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的建立與應(yīng)用

蔣文明，李 陽(yáng)，程善菊，劉華雷

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，國(guó)家禽流感專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266032）

1996年，我國(guó)首次從廣東省鵝體內(nèi)分離到H5N1亞型高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）[1]。從2003年末開(kāi)始，H5N1亞型禽流感疫情在東南亞多個(gè)國(guó)家的家禽中暴發(fā)，包括越南、泰國(guó)、韓國(guó)、日本、柬埔寨和印度尼西亞。2004—2015年，我國(guó)多個(gè)省份暴發(fā)H5N1亞型高致病性禽流感疫情，導(dǎo)致超過(guò)2 000萬(wàn)只禽類被撲殺，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。2005年底，我國(guó)針對(duì)H5亞型AIV開(kāi)始實(shí)行大規(guī)模強(qiáng)制免疫政策，并有效控制了疫情。實(shí)踐證明，在禽流感防控方面，疫苗免疫發(fā)揮了巨大作用[2]。但是不可否認(rèn)，疫苗免疫也帶來(lái)了一系列問(wèn)題，如加快了病毒變異速度，使得疫苗必須進(jìn)行相應(yīng)更新?lián)Q代[3]。我國(guó)使用的禽流感疫苗從最初的N28、Re-1到Re-4、Re-5，再到Re-6、Re-8，到最新的Re-11、Re-12一直在不斷更新。病毒變異是由于其血凝素（Hemagglutinin，HA）基因中核苷酸變異引起的。而核苷酸的加速變異會(huì)導(dǎo)致以HA基因?yàn)榘谢驒z測(cè)方法特異性、敏感性的下降，出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

現(xiàn)行檢測(cè)方法中，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《禽流感病毒RTPCR檢測(cè)方法》（NY/T 772—2013）采用的是普通RT-PCR方法。該方法檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，需電泳后判定結(jié)果，容易造成環(huán)境核酸污染。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法》（GB/T 19438.2—2004）因制定時(shí)間太久，可能已不能滿足臨床病毒變異檢測(cè)需求。本研究比對(duì)了近年來(lái)分離到的H5亞型HPAIV HA基因核苷酸序列，在其保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)引物和1條探針，建立了H5亞型HPAIV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，并進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的特異性和敏感性，同時(shí)與臨床上常使用的兩種試劑盒進(jìn)行對(duì)比，以期為該病的快速檢測(cè)、診斷提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 病毒

30株 H5亞 型 HPAIV（5株 H5N1、5株H5N2、15株H5N6、5株H5N8），H7N9、H9N2等亞型AIV，以及新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒：均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 試劑盒

QIAamp Viral RNA Mini Kit：購(gòu)自 Qiagen 公司；HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit：購(gòu)自Vazyme公司；TOPO載體克隆試劑盒：購(gòu)自CloneSmarter公司；禽流感（AIV-H5）核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自深圳匹基生物工程股份有限公司（批號(hào)20180302）；禽流感病毒H5亞型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司（批號(hào)AIVH5 20180702P）。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)近年來(lái)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的H5亞型AIV基因序列以及本室分離的H5亞型AIV序列，針對(duì)HA基因序列保守區(qū)，設(shè)計(jì)1對(duì)引物及1條探針（專利申請(qǐng)中，序列待公開(kāi)）。探針5'端標(biāo)記FAM，3'端標(biāo)記BHQ1。

1.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法建立

根據(jù)QIAamp Viral RNA Mini Kit操作說(shuō)明，提取H5亞型病毒RNA。在反應(yīng)體系中依此加入2×qRT-PCR Buffer 10.0 μL，引物、探針各 1.0 μL（10 μmol/L），Enzyme Mix 1.0 μL，最后加入RNA模板 6 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：50 ℃10 min，95 ℃ 2 min，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)（95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，收集熒光信號(hào)）。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，經(jīng)膠回收后連接TOPO載體，然后進(jìn)行測(cè)序。

1.5 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法優(yōu)化

對(duì)反應(yīng)體系中的不同引物和探針濃度組合（ 引 物 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 μmol/L， 探 針1.0、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 μmol/L）以及反應(yīng)體積（50、20 μL）和擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)參數(shù)（反轉(zhuǎn)錄5、10、15 min，退火延伸20、30 s）等條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化，以達(dá)到最優(yōu)組合。

1.6 敏感性試驗(yàn)

提取病毒RNA，用微量核酸分析儀測(cè)定病毒RNA含量。將RNA作10倍倍比稀釋，取6.0 μL稀釋后的RNA模板，加入到14.0 μL qRT-PCR預(yù)混液中，然后采用建立的熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，確定其靈敏度。

1.7 特異性試驗(yàn)

利用優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，分別檢測(cè)H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H7N9、H9N2， 以及新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒等常見(jiàn)禽類病毒，檢驗(yàn)該方法的特異性。

1.8 與臨床同類試劑盒比較

以10倍倍比稀釋的RNA為模板，對(duì)比本研究建立的方法與H5亞型AIV核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測(cè)試劑盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）、H5亞型AIV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒（北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司）的敏感性。以實(shí)驗(yàn)室分離測(cè)序確定的H5病毒RNA為模板，對(duì)比該方法與兩種試劑盒的特異性。

1.9 臨床應(yīng)用

利用建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，對(duì)臨床發(fā)病家禽的10份組織病料進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的建立及優(yōu)化

為驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物探針的設(shè)計(jì)，選取實(shí)驗(yàn)室保存的H5N6亞型AIV進(jìn)行熒光RTPCR檢測(cè)，結(jié)果在實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法中，H5引物探針能夠有效檢出H5N6亞型AIV，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 H5亞型AIV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR引物探針驗(yàn)證結(jié)果

為進(jìn)一步說(shuō)明反應(yīng)的特異性和準(zhǔn)確性，將熒光RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果在約120 bp處看到1條特異性擴(kuò)增條帶（圖2）；將擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后連接TOPO載體測(cè)序，證實(shí)該擴(kuò)增產(chǎn)物為H5亞型HA基因序列，表明本研究設(shè)計(jì)的H5亞型引物特異性強(qiáng)，熒光RT-PCR方法特異、準(zhǔn)確。

圖2 H5亞型AIV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

在實(shí)時(shí)熒光RT-PCR體系中，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系中不同引物和探針濃度組合、反應(yīng)體積、擴(kuò)增時(shí)反應(yīng)參數(shù)和循環(huán)次數(shù)等條件的摸索和優(yōu)化，建立了檢測(cè)H5亞型AIV的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，經(jīng)過(guò)反復(fù)優(yōu)化和驗(yàn)證，確定實(shí)時(shí)熒光RTPCR檢測(cè)方法的最適反應(yīng)總體積為50 μL（其中模板6 μL），最適引物濃度均為0.4 μmol/L，探針濃度均為0.3 μmol/L。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR最佳反應(yīng)條件和循環(huán)參數(shù)為：第1階段，反轉(zhuǎn)錄50 ℃ 10 min；第2階段，預(yù)變性95 ℃ 2 min；第3 階段，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。在第3階段每次循環(huán)的退火延伸時(shí)，收集熒光。試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。

2.2 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的特異性

利用建立的實(shí)時(shí)RT-PCR方法，分別對(duì)H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、H7N9、H9N2 等亞型AIV，以及新城疫病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該方法只能擴(kuò)增H5亞型AIV，對(duì)其他亞型AIV及其他禽病病毒擴(kuò)增均為陰性（圖3），表明該方法具有良好的特異性。

2.3 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的敏感性

先測(cè)定病毒RNA濃度，然后將提取的RNA依次作10倍比稀釋，每個(gè)稀釋度取6 μL作為模板進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，該方法可以檢測(cè)到0.1 fg（10-6稀釋）的RNA模板（圖4）。

圖3 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 與其他試劑盒的對(duì)比

以實(shí)驗(yàn)室分離測(cè)序確定的30份H5病毒RNA為模板，對(duì)比該方法與兩種試劑盒的特異性。結(jié)果顯示，本研究建立的方法可以將30份H5病毒全部檢出，檢出率為100%。H5亞型AIV核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測(cè)試劑盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）和H5亞型AIV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒（北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司）各有1份檢測(cè)為陰性，檢出率均為98%。

將1.6中的RNA依次作10倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度取6 μL為模板，分別用兩種商品化H5亞型AIV熒光RT-PCR試劑盒與本研究建立的方法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，本研究建立方法的靈敏度均比這兩種試劑盒提高了10倍（圖5），說(shuō)明該方法具有良好的敏感性。

圖5 兩種商品化H5亞型AIV熒光RT-PCR方法敏感性結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測(cè)

利用建立的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，對(duì)臨床發(fā)病家禽的10份組織病料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有6份陽(yáng)性。該方法與病毒分離結(jié)果相比，符合率為100%（圖6），說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確性。

圖6 該方法對(duì)臨床組織樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

隨著病毒進(jìn)化，H5亞型AIV一直在不斷變異。我國(guó)現(xiàn)在的流行毒株與1996年最初分離的病毒A/goose/Guangdong/1/1996（H5N1）HA核苷酸同源性僅 為 90.6%（Re-11）和91.2%（Re-12）。以Re-11和Re-12疫苗株為代表的第2.3.4.4分支和第2.3.2.1分支HA核苷酸同源性僅為88.5%。HA核苷酸的快速變異增加了以核苷酸為靶基因檢測(cè)方法的難度。

本研究建立和優(yōu)化了H5亞型AIV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，可以檢測(cè)出目前常見(jiàn)的H5亞型AIV（包括 H5N1、H5N2、H5N6、H5N8），與其他亞型AIV和其他禽類病原核酸均無(wú)交叉反應(yīng)。該方法的檢出率和檢測(cè)下限均優(yōu)于商品化H5 AIV核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測(cè)試劑盒（深圳匹基生物工程股份有限公司）和H5 AIV實(shí)時(shí)熒光RTPCR檢測(cè)試劑盒（北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司）。

4 結(jié)論

本研究建立的H5亞型AIV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，可用于H5亞型高致病性禽流感的流行病學(xué)調(diào)查、監(jiān)測(cè)和早期診斷。