兩種藍舌病病毒ELISA抗體檢測試劑盒的比較

韓佃剛，葉玲玲，祝 賀，臺曉媛，孫洪正，周曉黎，尹尚蓮，艾 軍

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學，云南昆明 650201；2. 昆明海關，云南昆明 650200；3. 石林彝族自治縣農(nóng)產(chǎn)品質量安全監(jiān)測站，云南石林 652200；4. 昆明市疾病預防控制中心，云南昆明 650228）

藍舌病（Bluetongue，BT）是由藍舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起反芻動物的一種非接觸性蟲媒傳播疫病。BTV 屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae），是一種主要由庫蠓傳播的環(huán)狀病毒。綿羊是本病的主要易感動物，山羊、牛、羚羊、駱駝及野生反芻類動物均對本病易感。反芻類動物感染BTV的病死率平均為30%，其中綿羊高達80%；牛和山羊常為隱性感染，偶有發(fā)病和死亡。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將BT列為法定通報多種動物共患疫病，我國將其列為一類動物疫病。目前未有人感染BTV的報道[1]。BT 1933年首次發(fā)現(xiàn)于牛[2]，目前分布廣泛于全球，美國、澳大利亞、法國、英國、西班牙、韓國等國家均有關于該病的報道。我國于1979年在云南省師宗縣首次發(fā)現(xiàn)BT。流行病學調查發(fā)現(xiàn)，我國已有 31個省（自治區(qū)、直轄市）發(fā)現(xiàn)BTV 抗體陽性家畜，并從云南、湖北和安徽等地自然感染羊體內分離獲得BTV[3]。BT嚴重損害畜產(chǎn)品國際貿易，是活牛、活羊貿易的重大阻礙，也是進行其他活畜、牲畜胚胎和精子貿易的障礙之一，引起全球各國高度關注。隨著我國從國外進口種用反芻動物種類和數(shù)量的增加，BT經(jīng)口岸傳入我國的風險加大，因此需要對進境動物嚴格實施檢疫監(jiān)管，防止該病傳入我國[4]。OIE推薦的BTV血清學檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、瓊脂免疫擴散試驗（AGID）、補體結合試驗（CFT）、病毒中和試驗（VNT）。競爭ELISA（C-ELISA）和阻斷ELISA（b-ELISA）是基于一種結合到BTV VP7核心蛋白氨基末端的特異性單克隆抗體而開發(fā)的檢測方法，在檢測中不會與其他蟲媒病病毒抗體產(chǎn)生交叉反應[5]。經(jīng)多個國際實驗室的比較研究，ELISA檢測程序目前已經(jīng)標準化，是檢測BTV抗體的一種常用方法[6]，可用于多種動物血清抗體檢測，其特異性和敏感性高，成本低，已被廣泛用于臨床BT的診斷檢測[7-8]。

目前商品化的BTV抗體ELISA檢測試劑盒主要由美國、法國、西班牙等國家生產(chǎn)。進口試劑盒價格較高，訂貨周期長，不能有效滿足基層動物檢疫機構開展大規(guī)模篩查需求，因而開發(fā)性價比高的國產(chǎn)試劑盒勢在必行。本試驗用的ELISA檢測試劑盒由昆明、深圳海關檢驗檢疫技術中心和云南省畜牧獸醫(yī)科學院等單位共同研制和轉化。昆明海關檢驗檢疫技術中心根據(jù)進出境動物檢疫需求，于20世紀80年代研制出BTV瓊擴抗體檢測試劑，并于2009年研制出BTV B-ELISA抗體檢測試劑盒[9]，2018年對該試劑盒生產(chǎn)工藝進行了改進（完成了ELISA試劑盒的抗原預包被和辣根過氧化物酶與單抗偶聯(lián)的工藝改進），研制的新型BTV ELISA抗體檢測試劑盒檢測時間由原來的4.5 h縮短至2.5 h。為進一步評估新型BTV ELISA抗體檢測試劑盒檢測臨床樣品的適用性，將自主研發(fā)的B-ELISA抗體檢測試劑盒（YN BTV B-ELISA）與法國ID.VET公司研制的ELISA抗體檢測試劑盒（ID.VET C-ELISA）進行比較試驗，以期為臨床檢測提供性價比高、使用方便、特異性高、靈敏度高的試劑盒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢血清 本實驗室保存的牛羊血清1 278份。任選1份已確定的羊陽性血清，按照20～2-9進行10倍倍比稀釋，共10份。

1.1.2 檢測試劑盒 BTV抗體B-ELISA 檢測試劑盒（以下簡稱YN BTV B-ELISA）：昆明海關檢驗檢疫技術中心試制，批號HM181005；BTV VP7蛋白抗體ELISA檢測試劑盒（以下簡稱ID.VET C-ELISA）：法國ID.VET公司研制，批號C42。

1.2 檢測方法

1.2.1 符合率比較 用2種ELISA試劑盒，對1 278份血清進行檢測，操作步驟和結果判定均參照相應試劑盒說明書進行。參考吳泰相等[10]的方法（表1），計算符合率、相對敏感性和相對特異性。符合率=(a+d)/(a+b+c+d)；相對敏感性=a/(a+c)；相對特異性=d/(b+d)；Kappa值計算公式：Kappa=2(ad-bc)/(p1q2+p2q1)。Kappa值 ＞0.8，表明一致性極高；0. 60＜Kappa值≤0. 80；表明高度一致；0. 40＜Kappa值≤0. 60；表明中度一致；Kappa值≤0. 40，表明一致性差[11]。

表1 兩種試劑盒一致性判定方法

1.2.2 敏感性比較 任選一份已確定的陽性血清，按照20～2-9進行10倍倍比稀釋，共10份，分別用2種ELISA試劑盒進行檢測。每個濃度的血清均做雙孔檢測，操作步驟參照相應試劑盒說明書進行。取2個檢測孔的OD平均值進行判定，比較兩種試劑盒的敏感性。

2 結果

2.1 符合率比較

用上述方法對1 278份血清樣品進行檢測，結果見表2。YN BTV B-ELISA試劑盒與ID VET C-ELISA試劑盒檢測比較結果顯示，兩者同時為陽性和陰性血清分別有267份、1 010份，YN BTV B-ELISA試劑盒陽性而ID.VET C-ELISA試劑盒陰性的血清0份，YN BTV B-ELISA試劑盒陰性而ID.VET C-ELISA試劑盒陽性的血清1份。YN BTV B-ELISA試劑盒與ID.VET C-ELISA試劑盒的符合率、相對敏感性、相對特異性分別是：(267+1 010)/1 278×100%=99.92%，267/268×100%=99.63%，1 010/1 010×100%=100%。將兩者一致性用Kappa值表示，Kappa =2(267×1 010-0×268)/(267×1 010+268×1 011)≈0. 998。

表2 YN BTV B-ELISA試劑盒與ID.VET C-ELISA 試劑盒檢測結果比較

2.2 敏感性比較

用上述方法對10個濃度的陽性血清樣品進行檢測，檢測結果見表3。同一份陽性血清10個濃度稀釋后的檢測結果顯示，ID.VET C-ELISA試劑盒檢測到的最低濃度為2-4，即按照1:16稀釋，而YN BTV B-ELISA試劑盒能檢測到的最低濃度為2-7，即按照1:128稀釋。檢測結果表明，YN BTV B-ELISA試劑盒的敏感性更高。

表3 YN BTV B-ELISA試劑盒與ID.VET C-ELISA 試劑盒敏感性比較

3 討論

兩種試劑盒設計原理相同，均為基因工程表達的VP7蛋白預包被ELISA板，反應程序均為加樣品后孵育一定時間，不洗板，加HRP標記的單抗，反應一定時間后，洗板，顯色。根據(jù)對1 278份樣品檢測的比較評估，發(fā)現(xiàn)兩者的符合率較高，因而推測兩種試劑盒的單抗可能作用于VP7蛋白的同一靶位點。反映試驗判定結果與標準診斷結果一致性的2個指標是符合率和Kappa值，而反映試驗結果真實性是特異性和敏感性[12-13]。試劑盒敏感性高低會直接影響對同一樣品的判定，在檢測時敏感性低，對弱陽性樣品會出現(xiàn)假陰性，漏檢的可能性增加。為保證檢測結果的準確性和可靠性，實驗室在使用試劑盒前應對其進行測試驗證。在測試驗證時，測試樣品的范圍要廣，應盡可能多地選取不同的、有代表性的測試樣品[14]。本次測試的樣品為來自澳大利亞、新西蘭和云南邊境地區(qū)的牛羊血清，樣品范圍在動物品種上涵蓋了牛和羊，在地域上涵蓋了國內和國外，因而具有一定的代表性。

4 結論

本次比對結果表明，YN BTV B-ELISA試劑盒與ID.VET C-ELISA檢測試劑盒之間的符合率、相對特異性、相對敏感性都較高，在動物疫病群體檢測中無根本性差別，并且YN BTV B-ELISA試劑盒的敏感性更高，成本更低。這些特點表明YN BTV B-ELISA試劑盒在大規(guī)模樣品檢測中的優(yōu)勢更加明顯。