響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素基載體固定糖化酶的研究

陳俊英，周航宇，唐煥妍，白 凈，趙富強(qiáng)，李清亮

(1.鄭州大學(xué) 化工與能源學(xué)院，河南 鄭州450001；2.河南省杰出外籍科學(xué)家工作室，河南 鄭州450001)

0 引言

糖化酶可將淀粉完全分解成葡萄糖［1-2］，廣泛用于酒精、葡萄糖、抗生素、有機(jī)酸等物質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn).在酶催化反應(yīng)中，游離酶具有難與底物分離，不能重復(fù)利用，易失活等缺點(diǎn)；而固定化酶易與底物分離，可重復(fù)使用，可連續(xù)生產(chǎn)，穩(wěn)定性好［3-4］.酶的固定化通常分為載體結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法及新型的定向固定法［5-9］，包埋法制備的固定化酶具有條件溫和、酶包埋率不受保護(hù)劑及穩(wěn)定劑的影響等優(yōu)點(diǎn)，因此，本試驗(yàn)采用包埋法制備固定化酶，并且選擇纖維素作為載體材料.與其他載體［10-14］相比，纖維素是具有一定空間結(jié)構(gòu)的天然有機(jī)高分子多糖物質(zhì).纖維素疏松的孔隙以及長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)有利于滲透和吸附大分子，具有生物相容性好，無(wú)毒，可降解，價(jià)格低廉，適合作為固定化酶的載體材料.

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

糖化酶由河南天冠企業(yè)集團(tuán)提供，原液酶活力約為100 000 U/mL.

海藻酸鈉為化學(xué)純，3，5-二硝基水楊酸、微晶纖維素、氯化鈣、酒石酸鉀鈉、苯酚、無(wú)水亞硫酸鈉、乙酸、結(jié)晶乙酸鈉、氫氧化鈉均為分析純.

1.2 試驗(yàn)儀器

LDZF-30KB-Ⅲ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；AL204電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；NDJ-79型旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)，同濟(jì)大學(xué)機(jī)械廠(chǎng)；恒溫水浴振蕩器；WFZ UV-2012 PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司.

1.3 測(cè)定方法

黏度測(cè)定:用NDJ-79型旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì).

酶活測(cè)定方法:3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法［15-16］.

建立葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=3.395 3x+0.193 0，x為吸光度；y為葡萄糖濃度，mg/mL；得到的線(xiàn)性回歸系數(shù)R2為0.999 2.

1.4 相關(guān)試劑與固定化酶的制備

(1)DNS試劑:準(zhǔn)確稱(chēng)取3，5-二硝基水楊酸10 g，氫氧化鈉10 g，酒石酸鉀鈉200 g，重蒸苯酚2 g，無(wú)水亞硫酸鈉5 g.用500 mL水在45℃水浴中溶解至澄清后，放置冷卻至室溫.然后加水定容到1 000 mL，濾除雜質(zhì)后移至棕色試劑瓶中避光干燥存放7 d后方可使用.

(2)葡萄糖溶液(10 mg/mL):稱(chēng)取一定質(zhì)量的無(wú)水葡萄糖在103℃下烘干到質(zhì)量恒定，精準(zhǔn)測(cè)取1 g，用水溶解并定容至100 mL.

(3)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別吸取(2)中的葡萄糖溶液 0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻備用.

(4)2%的可溶性淀粉溶液(文中百分?jǐn)?shù)不加特殊說(shuō)明，均指質(zhì)量百分?jǐn)?shù)):稱(chēng)取淀粉20 g在蒸餾水中加熱溶解，然后定容至1 000 mL.

(5)0.05 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH4.6):稱(chēng)取質(zhì)量為 6.7 g的乙酸鈉，吸取2.6 mL冰乙酸，用水溶解并定容至1 000 mL，再使用pH計(jì)校正至pH=4.6即可.

(6)包埋糖化酶的纖維素-海藻酸鈣凝膠［17-20］:測(cè)定經(jīng)過(guò)殺菌的纖維素和海藻酸鈉混合液黏度后，加入2.0 mL糖化酶原液攪拌均勻，取注射器將混合溶液滴加至氯化鈣溶液中，反應(yīng)2 h.濾出纖維素-海藻酸鈣凝膠顆粒后用水洗幾次，再次移入到氯化鈣溶液中，在4℃冰箱中平衡12 h.取出后用蒸餾水洗滌多次，放入冰箱中過(guò)夜.

1.5 糖化酶酶活的測(cè)定

(1)原酶液酶活力測(cè)定:在50 mL錐形瓶中分別加入25.0 mL當(dāng)天配置的可溶性淀粉溶液和5.0 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，先放入40℃的恒溫槽預(yù)熱5 min，后加入2.0 mL稀釋500倍的酶液，準(zhǔn)確反應(yīng)1 h.反應(yīng)結(jié)束后，加入0.2 mL 20%NaOH溶液終止反應(yīng)，冷卻至室溫.將待測(cè)溶液稀釋5倍后測(cè)定吸光度及葡萄糖含量.

(2)固定化糖化酶酶活力測(cè)定:測(cè)定方法同(1)，其中加入的待測(cè)固定化糖化酶量為2 g，反應(yīng)結(jié)束后，及時(shí)分離固定化酶顆粒與反應(yīng)液，冷卻至室溫.

糖化酶活力(U/mL)計(jì)算:

式中:y為根據(jù)吸光度由回歸方程計(jì)算的含糖量，mg/mL；5為待測(cè)液的稀釋倍數(shù)；32.2為反應(yīng)體系的總體積，mL；2為加入了2 mL的酶液參加反應(yīng)，mL；500為待測(cè)酶液的總稀釋倍數(shù).

式中:30.0為反應(yīng)體系總體積，mL；2為包埋制固定化酶加入的酶液體積，mL；m總為固定化酶顆?？傎|(zhì)量，g；m為參與反應(yīng)固定化酶顆粒質(zhì)量，g.

1.6 對(duì)固定化酶活力影響的單因素試驗(yàn)研究

(1)纖維素-海藻酸鈉混合液質(zhì)量濃度的影響

取氯化鈣溶液的質(zhì)量濃度為20.0 mg/mL，包埋酶量為2.0 mL，取最合適的纖維素-海藻酸鈉用量比例，設(shè)定纖維素-海藻酸鈉混合溶液質(zhì)量濃度分別為 20.0、25.0、30.0、35.0、40.0 mg/mL，制備固定化酶，考察其對(duì)酶活的影響.

(2)氯化鈣溶液質(zhì)量濃度的影響

取包埋酶量為2.0 mL，按最佳纖維素-海藻酸鈉用量比例，最適纖維素-海藻酸鈉混合溶液質(zhì)量濃度，設(shè)定氯化鈣溶液質(zhì)量濃度分別為20.0、30.0、40.0、50.0、60.0 mg/mL，制備固定化酶，考察其對(duì)酶活的影響.

(3)纖維素、海藻酸鈉質(zhì)量比例的影響

取纖維素-海藻酸鈉混合溶液和氯化鈣溶液的質(zhì)量濃度均為 20.0 mg/mL，包埋酶量為2.0 mL，設(shè)定纖維素-海藻酸鈉的質(zhì)量比分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2，按照上述方法制備固定化酶，測(cè)酶活，考察對(duì)酶活的影響.

1.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本次試驗(yàn)采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件和BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法處理數(shù)據(jù).根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)因素選擇纖維素-海藻酸鈉用量比(A)、纖維素-海藻酸鈉混合溶液質(zhì)量濃度(B，%)、氯化鈣溶液質(zhì)量濃度(C，%)，響應(yīng)值用酶活力表示，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，從而確定最優(yōu)的固定化糖化酶條件.其中A取值為 3、2、1，B 取值為 2.0、2.5、3.0，C 取值為1.0、2.0、3.0.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同因素對(duì)固定化糖化酶活力的影響

2.1.1 纖維素-海藻酸鈉混合溶液質(zhì)量濃度對(duì)固定化糖化酶活力的影響

由圖1纖維素-海藻酸鈉混合溶液質(zhì)量濃度對(duì)固定化糖化酶活力的影響可知，隨著混合溶液質(zhì)量濃度的增加，固定化酶活力呈現(xiàn)先增大后減小然后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì).質(zhì)量濃度越大，形成的顆粒越大，而總的接觸面變??；另外，混合溶液的質(zhì)量濃度增大，海藻酸鈉的含量也增加，使得顆粒結(jié)構(gòu)緊湊，不利于活性位點(diǎn)的顯現(xiàn)，造成酶活降低，但總的來(lái)說(shuō)纖維素-海藻酸鈉混合溶液質(zhì)量濃度對(duì)固定化糖化酶整體活力的影響較小.

2.1.2 氯化鈣溶液質(zhì)量濃度對(duì)固定化糖化酶顆粒形狀及活力的影響

試驗(yàn)中氯化鈣溶液質(zhì)量濃度越大，滴入的復(fù)合溶液進(jìn)入氯化鈣溶液內(nèi)部的阻力就越大.在滴加過(guò)程中，顆粒會(huì)漂浮在表面，形成障礙面，阻礙后續(xù)滴入溶液接觸氯化鈣.由于障礙面的存在，凝膠顆粒形狀不均勻，或大或小，或不成球形，在不同濃度氯化鈣溶液中固定化酶顆粒形狀如圖2所示.圖3為對(duì)酶活力的影響.

圖1 纖維素-海藻酸鈉混合溶液質(zhì)量濃度對(duì)固定化糖化酶活力的影響Fig.1 Effects of mass concentration of the mixed solution on enzyme activity of immobilized glucoamylase

圖2 在不同濃度氯化鈣溶液中固定化酶顆粒形狀Fig.2 The shapes of immobilized glucoamylase in the different concentrations of calcium chloride solution

由圖3可知，隨著氯化鈣溶液質(zhì)量濃度的增大，固定化后酶活力先增大后減小.氯化鈣溶液質(zhì)量濃度為2%時(shí)固定化糖化酶活力最好.海藻酸鈉的分子結(jié)構(gòu)會(huì)受離子濃度的影響，離子濃度越大，作用越大，在離子濃度過(guò)大時(shí)，酶活力受到影響而減小.

圖3 氯化鈣溶液質(zhì)量濃度對(duì)固定化糖化酶活力的影響Fig.3 Effects of mass concentration of calcium chloride solution on enzyme activity of immobilized glucoamylase

2.1.3 纖維素-海藻酸鈉質(zhì)量比對(duì)固定化糖化酶活力的影響

圖4為纖維素-海藻酸鈉質(zhì)量比對(duì)固定化糖化酶活力的影響.一定范圍內(nèi)，隨著纖維素用量的增加，固定化糖化酶活力逐漸升高，當(dāng)纖維素-海藻酸鈉質(zhì)量比超過(guò)2∶1時(shí)，固定化酶活力有所降低.海藻酸鈉具有低濃度高黏度的性質(zhì)，海藻酸鈉比例高會(huì)影響所包埋酶活性位點(diǎn)的暴露，以致固定化后的糖化酶活力減少.而當(dāng)海藻酸鈉量太少時(shí)，則影響固定化酶的成球性能，難以得到相似的規(guī)則顆粒，且酶顆粒的硬度低、機(jī)械強(qiáng)度弱，顆粒形狀小.

圖4 纖維素-海藻酸鈉質(zhì)量比對(duì)固定化糖化酶活力的影響Fig.4 Effects of mix proportion of cellulose and sodium alginate

2.2 固定化糖化酶制備條件優(yōu)化

以固定化酶酶活為響應(yīng)值，響應(yīng)面的試驗(yàn)方案和結(jié)果如表1所示.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)矩陣及結(jié)果Tab.1 Results of response surface experiments

應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了多元回歸擬合，得到下面的回歸方程:

酶活力=2 747.51+317.17A+110.38B+322.49C+62.78AB+174.74AC+346.00BC-286.44A2-295.30B2-512.18C2.

表2為回歸模型及方差分析結(jié)果.由表2可知，模型的P值為0.027 0，失擬項(xiàng)的值是0.054 0，模型擬合效果顯著，且失擬項(xiàng)不顯著說(shuō)明模型擬合度好［21-22］.從纖維素-海藻酸鈉質(zhì)量比例、纖維素-海藻酸鈉混合溶液質(zhì)量濃度、氯化鈣溶液質(zhì)量濃度的F值來(lái)看，影響酶活力值的強(qiáng)度由大到小依次為:氯化鈣溶液質(zhì)量濃度、纖維素-海藻酸鈉質(zhì)量比例、纖維素-海藻酸鈉混合溶液質(zhì)量濃度.由響應(yīng)面試驗(yàn)得到的模型復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.920 6，校正后的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2為0.777 6，表明模型的相關(guān)性較好；變異系數(shù)表示的是試驗(yàn)數(shù)據(jù)的離散程度，變異系數(shù)的值越大表示試驗(yàn)的可信度越小，本試驗(yàn)的變異系數(shù)(C.V.%)的值為11.77，由此說(shuō)明試驗(yàn)操作是可靠的；信噪比的值大于4則表示模型可用于預(yù)測(cè)，本試驗(yàn)的信噪比為6.643，大于4，所以由軟件得出的模型可用來(lái)預(yù)測(cè)［23-25］.

表2 回歸模型及方差分析結(jié)果Tab.2 Results of regression model and variance analysis

圖5為各因素交互作用對(duì)固定化酶活力影響的響應(yīng)曲面.固定化糖化酶的最佳工藝條件是:纖維素-海藻酸鈉用量比例為1.5∶1，纖維素-海藻酸鈉混合溶液質(zhì)量濃度為2.80%，氯化鈣溶液質(zhì)量濃度為2.77%.

圖5 各因素交互作用對(duì)固定化酶活力影響的響應(yīng)曲面Fig.5 The interactive influences of the parameters on enzyme activity of immobilized glucoamylase

2.3 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

模型預(yù)測(cè)最優(yōu)條件下理論酶活力為2 984 U/mL.在由軟件優(yōu)化得出的最優(yōu)條件下制備固定化糖化酶，進(jìn)行了三組平行驗(yàn)證性試驗(yàn)，測(cè)得的平均酶活力為2 880 U/mL，與模型預(yù)測(cè)理論值相近，可以看出模型是可靠的.

2.4 不同吸附情況對(duì)比

吸附試驗(yàn)步驟:取一定量經(jīng)晾干7 h后的固定化糖化酶小球于5.0 mL原酶液中進(jìn)行吸附試驗(yàn)，吸附時(shí)間為1 h；分離吸附后的固定化酶顆粒與酶液，自然晾干吸附后固定化酶顆粒2 h，稱(chēng)其質(zhì)量.

分別取在最優(yōu)方案下制備的固定化糖化酶顆粒2 g，吸附試驗(yàn)最優(yōu)條件下制備的固定化糖化酶0.999 8 g，做重復(fù)使用試驗(yàn)，用于可溶性淀粉溶液的分解，每次反應(yīng)1 h，多次進(jìn)行反應(yīng).后用分光光度計(jì)測(cè)反應(yīng)液的吸光度，計(jì)算其含糖量，考察固定化糖化酶分解淀粉的能力.固定化糖化酶的重復(fù)使用性試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示.

圖6 固定化糖化酶重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Reusability of immobilized glucoamylase

由圖6可知，未吸附的固定化酶重復(fù)使用性較差，吸附后的固定化酶重復(fù)使用性較好.隨著反應(yīng)次數(shù)的增加，未吸附的淀粉量減少，反應(yīng)液含糖量也減少.隨著反應(yīng)次數(shù)的增加，未吸附的固定化酶分解淀粉的能力快速降低，使用3次后固定化酶分解淀粉的能力僅為原來(lái)的48%.吸附后的固定化糖化酶分解淀粉的能力降低得較緩慢，有一段較平穩(wěn)期，如2～8次，反應(yīng)8次后固定化糖化酶分解淀粉的能力仍有原來(lái)的50%.

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了固定化糖化酶的工藝條件，優(yōu)化后的工藝條件為:纖維素-海藻酸鈉用量比例為1.5∶1，纖維素-海藻酸鈉混合溶液質(zhì)量濃度為2.80%，氯化鈣溶液質(zhì)量濃度為2.77%.驗(yàn)證試驗(yàn)所得酶活力為2 880 U/mL，與理論值2 984 U/mL較接近，表明該模型可用于試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè).

本研究還對(duì)固定化酶進(jìn)行了吸附酶液試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明僅用包埋法制備的固定化糖化酶重復(fù)使用性較差，包埋并且吸附酶液的固定化糖化酶重復(fù)使用性較好.