JMJD1A促進膠質瘤增殖侵襲的分子機制探究

劉坤 許惠娟 管瑛瑛 陳桓 張福漢 宿杰阿克蘇 侯英勇 許建芳

腦膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的一種惡性腫瘤，具有高侵襲性、高復發(fā)率和高死亡率等特點[1-3]。盡管研究者在膠質瘤惡性進展方面開展了大量研究，目前臨床仍然沒有有效的治療和早期診斷策略。據報道，JMJD1A的表觀遺傳調控在精子發(fā)生、新陳代謝、性別決定、干細胞自我更新和分化等生物過程中起著不同的作用[6-12]。目前，JMJD1A已經被發(fā)現在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，但是在膠質瘤中還未見報道。本文旨在進一步了解JMJD1A在膠質瘤增殖侵襲過程中的作用，期望為膠質瘤的診斷治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 腦膠質瘤標本收集

收集2016年1—12月復旦中山醫(yī)院手術切除并經病理科確診為腦膠質瘤的10例臨床組織標本。

1.2 Western Blot實驗

配制12%分離膠與4%濃縮膠，SDS PAGE電泳1.5小時，電流為濃縮膠25 mA，分離膠30 mA。轉膜，脫脂奶粉封閉，一抗4℃過夜，二抗37℃孵育1小時，暗室內曝光顯影。

1.3 細胞株及主要試劑

膠質瘤細胞株購于中科院上海細胞生物所；Western-blot抗體購于CST公司；MTS試劑盒購于Promega公司；Transwell試劑盒購于Millipore公司；siRNA購于上海吉凱公司。

1.4 細胞株培養(yǎng)

人膠質瘤細胞系U87和U251用10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并加入青霉素（100 U/mL）和鏈霉素（100 mg/L），置于37℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.5 細胞轉染

細胞匯合度至70%～90%時，用DharmaFECT進行細胞轉染。實驗為3組，未處理組細胞（Mock）加入培養(yǎng)基，陰性對照組（siC）加入無意義序列，JMJD1A干擾組（siJMJD1A）加入JMJD1A特異性干擾序列siRNA。

1.6 MTS增殖實驗

每隔24小時，每孔加入20ulMTS試劑37°C培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后在490 nm波長進行吸光度檢測。

1.7 細胞Transwell侵襲實驗

將500 μL轉染細胞制備的無血清懸浮液加入到每個小室的內部（8 μm孔徑），10%FBS的500 μL培養(yǎng)基添加到下層孔內。孵育24 h后，穿過膜的下層膜細胞用Gimesa染色20 min，顯微鏡下計數。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用GraphPad Prism5統(tǒng)計學軟件，計量資料以（均數±標準差）表示，采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的計量資料，采用非參數秩和檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 JMJD1A在膠質瘤組織中顯著過表達

通過Western Blot 方法和搜索 TCGA數據庫，發(fā)現與正常腦組織相比，膠質瘤中JMJD1A的蛋白和mRNA水平顯著升高（P＜0.01，圖1）。該結果提示該基因可能參與膠質瘤發(fā)生發(fā)展過程。

2.2 siRNA干擾降低膠質瘤細胞中JMJD1A的表達

接下來選取了兩株膠質瘤細胞系 U87和 U251。利用siRNA干擾細胞中 JMJD1A的表達。Western Blot結果顯示，與未處理組細胞（Mock）和對照組細胞（siC）相比，siRNA可顯著降低細胞中JMJD1A蛋白表達水平。

2.3 干擾JMJD1A表達顯著抑制膠質瘤細胞增殖能力

圖1 膠質瘤中JMJD1A蛋白及mRNA水平檢測

圖2 JMJD1A干擾效率檢測

圖3 干擾JMJD1A表達對細胞增殖速率的影響

圖4 干擾JMJD1A表達對細胞侵襲能力的影響

本研究使用MTS方法檢測JMJD1A對膠質瘤細胞增殖的影響。MTS結果顯示，與未處理組Mock與對照組siC相比，JMJD1A干擾組細胞（siJMJD1A）增殖速率顯著降低（P＜0.05，圖3），說明JMJD1A下調可以顯著抑制膠質瘤細胞的增殖能力。

2.4 干擾JMJD1A表達顯著抑制膠質瘤細胞侵襲能力

Transwell結果顯示，與未處理組Mock與對照組siC相比，JMJD1A干擾組細胞（siJMJD1A）侵襲細胞數量顯著降低（P＜0.05，圖4）。結果說明JMJD1A下調可抑制膠質瘤細胞的侵襲能力。

3 討論

膠質瘤是死亡率最高的中樞神經系統(tǒng)腫瘤。在過去的十年里，由于腫瘤分子生物學技術的進展，膠質瘤的分型發(fā)生了巨大的變化[1]。目前，膠質瘤的治療主要是手術治療和放化療治療。其中，手術切除腫瘤通常是首選的治療策略。然而，高級別膠質瘤如膠質母細胞瘤，由于其增殖侵襲等特點，使得手術不能到達完全治愈的效果，患者極易復發(fā)，且預后很差[2-3]。JMJD1A這種組蛋白去甲基酶，會參與細胞表觀遺傳調控[4-5]。研究發(fā)現JMJD1A在多種腫瘤中都存在異常表達并發(fā)揮著促進腫瘤的作用，如前列腺癌、結腸癌、肝細胞癌和肉瘤[6-12]。本研究在膠質瘤組織中，發(fā)現JMJD1A表達水平存在顯著增加的現象。通過siRNA干擾技術降低了膠質瘤細胞系中JMJD1A的表達水平。進一步通過體外分子方法檢測干擾JMJD1A表達后膠質瘤細胞增殖侵襲的變化。本研究結果證實了JMJD1A下調能顯著抑制膠質瘤細胞的增殖侵襲能力。本研究可為膠質瘤的臨床診斷及治療靶點提供潛在的理論依據。