電針對受損展神經小膠質細胞分型的影響*

王 蕾, 張 毅，嚴紅燕, 王旭東

(南通大學第二附屬醫(yī)院 1急診中心， 2神經外科， 3中醫(yī)科， 江蘇 南通 226001)

展神經由于缺乏神經外膜、基底膜和牢固的神經束膜包被，且缺少連接神經束的結締組織，修復存在困難[1]，而小膠質細胞作為中樞神經系統(tǒng)的免疫吞噬細胞，在不同的微環(huán)境中可以表現(xiàn)為不同的細胞亞型：經典激活M1型與選擇激活M2型。M1型主要誘導免疫炎癥反應，但過多的炎癥反應因子也會導致正常細胞的損傷及凋亡[2]; M2型小膠質細胞主要抑制機體過度的免疫反應，促進炎癥修復，保證神經修復與再生[3]。作為中國傳統(tǒng)醫(yī)學重要的一種非藥物治療方法，針刺的基礎研究及臨床試驗均發(fā)現(xiàn)，電針刺激受損神經可有效地提高該神經功能恢復率[4]。本研究觀察電針對Beagle犬展神經損傷模型中小膠質細胞表型的影響，初步探討小膠質細胞的活化狀態(tài)對于展神經損傷治療的臨床意義。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

選用普通級健康Beagle犬(6月齡,n=20)，雌雄各半，體重(15±0.5) kg，由南通大學醫(yī)學院動物實驗中心提供，許可證號:SCXK(蘇)2008-0010。實驗動物飼養(yǎng)于單獨的犬房，可自由走動，12 h給予光照-黑暗的周期循環(huán)模式，保證適宜的溫度進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)2周進行實驗。實驗動物治療4周取材，動物的處理遵守國家健康協(xié)會制定的實驗動物使用指南。

2 實驗方法

2.1展神經損傷模型的建立及分組 術前12 h禁食后注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)靜脈麻醉。將Beagle犬置于手術臺采取側臥位，固定實驗動物頭顱，耳緣牽向尾側固定，麻醉充分開顱后皮瓣翻向外側，經顳肌附著處縱向切開。經顳底入路開顱，骨窗盡量靠近顱底，擴大骨窗范圍從眶后到顴弓前，并沿顳骨窗下緣切開硬腦膜沿斜坡向上外方做一創(chuàng)口約3.5 cm×3.5 cm。向內、上方牽拉顳葉牽開腦組織，磨除巖骨前部分暴露深部的展神經。用有齒止血鉗擠壓夾閉展神經30 s后直視鉗壓處組織菲薄，切斷展神經軸突但維持神經鞘膜完整性，以犬眼球呈內斜視表明造模成功，連續(xù)2周，每次持續(xù)15 min。實驗分為：正常對照(control, C)組：不進行任何神經損傷處理，正常喂養(yǎng)對照;假手術(sham operation, S)組：僅暴露分離展神經，術中不進行神經損傷處理，縫合切口皮膚，在電針刺激時進行束縛；損傷(injury, I)組：制作展神經損傷模型，將電極插入外直肌但不進行脈沖刺激；電針處理(electroacupuncture, E)組：Beagle犬展神經損傷模型建立后進行電針刺激，插入位置與I組相同，I組同時在E組進行電針刺激時進行束縛。

2.2電針刺激 E組展神經損傷模型制作完成后將2個電極(5 F導管)分別置入神經損傷處2側。向外方牽拉上下眼瞼，在瞼板與球結膜交界處充分暴露外直肌，將電極均插入外直肌，植入深度約3.0 mm，間距約4.0 mm，縫合切口固定電極。游離端自眼眶后下方引出固定，形成回路，術后連續(xù)2周給予電針刺激，，每次持續(xù)15 min。參數(shù)設置：脈沖頻率為5 Hz，時程0.1 ms，強度1.0 V。

2.3細胞培養(yǎng)和傳代 Beagle犬麻醉后，無菌操作下迅速取下犬眼內的視神經(展神經)，放在Hanks液中洗去血液，在體視顯微鏡下剝離神經鞘膜；用已滅菌的剪刀機械將組織剪碎，加入0.25%的胰酶后放37 ℃烘箱消化3次，每次3 min，完全培養(yǎng)液(基礎培養(yǎng)液∶小牛血清∶胎牛血清=8∶1∶1)終止消化；每次將消化液經100目篩濾下，收集3次消化濾液14 000×g離心5 min，棄去上清，完全培養(yǎng)液重懸細胞，轉入12孔板中；37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min后，轉移上清至新的12孔板中繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)2周時間，待細胞平鋪開，200 r/min搖床振蕩4 h，取上清至新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)細胞恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

2.4Western blot檢測小膠質細胞的M1和M2標志性分子表達 所有實驗動物4周取材進行Western blot檢測展神經小膠質細胞標志分子的表達水平。取上述各組Beagle犬每組5只，用10%水合氯醛進行深度麻醉后，迅速用手術剪剪下展神經節(jié)段，在低溫無菌冰盤上進行操作，分離出少許神經組織置于1 mL勻漿器球狀部位，盡量充分剪碎組織。加入含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)的400 μL單去污劑裂解液進行勻漿。裂解30 min后在4 ℃、 12 000×g離心10 min，取上清分裝置于-20 ℃保存。提取小膠質細胞的總蛋白，通過NanoDrop定量，取40 ug蛋白進行SDS-PAGE，將蛋白以恒定電流30 mA，電轉90 min轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)膜上，TBST洗膜3次，然后含5%TBST的脫脂奶粉以60 r/min的速度封閉60 min，加入I抗[稀釋度：白細胞介素1β (interleukin 1β, IL-1β)為1∶200，誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)為1∶3 000，精氨酸酶(arginase)為1∶1 000，腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)為1∶200]4 ℃冰箱孵育過夜，I抗孵育完成后TBST漂洗3次，再移至新雜交袋中，與熒光標記II抗(1∶20 000)常溫孵育60 min， TBST充分清洗后以增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)法顯影并拍照，進行條帶灰度分析。

3 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 19.0對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。小膠質細胞M1和M2型標志分子表達水平用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 電針治療后展神經小膠質細胞M1表型標志物的比較

4組均檢測到M1特異性標志分子(iNOS和IL-1β)。I組iNOS的表達較C組比較增加(P<0.05)；而E組iNOS表達較I組明顯降低(P<0.05)，同時與C組及S組比較均無顯著差異。I組和E組IL-1β的表達與C組比較均增加(P<0.05)；與I組相比，E組IL-1β降低(P<0.05),見圖1、表1。

Figure 1.The expression of M1 and M2 phenotype markers of abducens nerve microglia was detected by Western blot.

圖1展神經小膠質細胞M1和M2表型標志物的表達

表1各組展神經小膠質細胞M1表型標志物的比較

Table 1.Comparison of M1 phenotype markers of abducens nerve microglia in each group (Mean±SD.n=5)

GroupiNOSIL-1βC0.09±0.290.01±1.05S0.11±0.930.02±1.29I 0.31±0.89?0.09±1.15?E 0.14±1.01△ 0.05±0.91?△

*P<0.05vsC group；△P<0.05vsI group.

2 電針治療后展神經小膠質細胞M2表型標志物的比較

M2特異性標志蛋白(arginase和BDNF)在4組均被檢測出。與C組相比，I組和E組arginase表達均增加(P<0.05)；而E組的arginase表達較I組增加(P<0.05)。BDNF在I和E組的表達均增加(P<0.05)；而E組的BDNF較I組表達增加(P<0.05),見圖1、表2。

表2各組展神經小膠質細胞M2表型標志物的比較

Table 2.Comparison of M2 phenotype markers of abducens nerve microglia in each group (Mean±SD.n=5)

GroupArginaseBDNFC0.21±1.220.04±0.07S0.25±1.140.05±1.08I 0.38±1.03? 0.49±0.78?E0.67±0.89?△0.82±0.68?△

*P<0.05vsC group；△P<0.05vsI group.

討 論

電針治療通過調節(jié)炎癥因子釋放、改善代謝微環(huán)境，減輕損傷細胞炎癥反應和抑制神經細胞凋亡從而產生神經保護作用[5-6]。目前研究主要集中在面神經和坐骨神經損傷修復，在動眼神經損傷修復亦有相關研究。同時利用電針刺激展神經麻痹亦取得了較好的療效，但關于針刺相關研究集中在腦血管病，而在展神經修復機制研究較少[7-8]。我們前期研究顯示電針刺激可以明顯促進損傷的展神經恢復[9]，但機制尚不明確。

大腦主要的免疫細胞——小膠質細胞約占大腦膠質細胞總數(shù)的20%左右[10]，其中經典激活M1型表面抗原包括CD80、CD86和主要組織相容性復合體Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ, MHCⅡ)等，在應激狀態(tài)下通過IL-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)等促炎因子分泌，主要誘導iNOS合成，對神經細胞產生毒性作用[11]。而對于神經保護作用主要依靠選擇激活M2型，主要參與神經細胞再生及凋亡組織細胞的吞噬清理[12]，表面抗原主要為Ym-1、CD206和arginase等，通過分泌IL-10、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、IL-4、IL-3 和胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)等抗炎因子及BDNF、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)等營養(yǎng)因子抑制神經細胞炎癥反應[13-14]。有研究表明缺血性腦卒中后分泌BDNF通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)及磷酯酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)2條信號通路發(fā)揮小膠質細胞保護作用[15]。所以我們大膽猜測BDNF在展神經細胞修復中亦發(fā)揮保護作用，本研究與之相符。另外arginase能預防細胞外基質降解，抑制小膠質細胞遷移，促進功能性突觸形成而降低神經元損害[16]，是M2重要的標志蛋白之一。

本研究中我們觀察電針對Beagle犬展神經損傷模型中小膠質細胞表型的影響，探索電針治療受損展神經的修復機制。Western blot檢測展神經小膠質細胞標志分子表達水平的結果中，C組與S組比較無顯著差異，即可排除手術創(chuàng)傷對實驗結果的影響。實驗結果還提示電針治療后M1型標志蛋白水平趨于對照組，而M2特異性標志蛋白較對照組明顯增加。上述結果表明電針治療能改善受損展神經的修復情況，機制可能與調控小膠質細胞M1和M2型標志蛋白表達相關。我們選擇的時點不能顯示出全部小膠質細胞M1和M2表型標志物的變化規(guī)律，今后的實驗還需擴大檢測范圍和動態(tài)監(jiān)測。