高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定杏貝止咳顆粒中貝母素甲和貝母素乙含量

楊智慧 ，程 誠 ，高曉燕

（1.江蘇省連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，江蘇 連云港 222006； 2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

杏貝止咳顆粒由麻黃、前胡、浙貝母、桔梗、苦杏仁、百部、甘草等12種中藥組方，有清宣肺氣、止咳化痰功效，臨床主要用于外感咳嗽的治療[1]。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為原國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)在定性鑒別之外，僅對苦杏仁中的苦杏仁苷進(jìn)行了含量控制[1]。方中浙貝母有清熱化痰、潤肺止咳功效，貝母素甲和貝母素乙為其主要活性成分[2-3]。本研究中采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）法測定兩成分含量，為完善該藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括1260 Infinity蒸發(fā)光散射檢測器（美國Agilent公司）；BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q Intergral 3型超純水機(jī)（美國Millipore公司）；SK250HP型超聲波清洗儀（上海利導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

貝母素甲對照品（批號為110750-201612，純度為96.2%），貝母素乙對照品（批號為110751-201712，純度為97.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；杏貝止咳顆粒（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號分別為170721，170906，171108，規(guī)格為每袋 4 g）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：70% 乙腈溶液 （含 0.08% 二乙胺）；流速：0.8 mL/min；ELSD 漂移管溫度：85℃；載氣（氮?dú)猓┝魉伲?.1 L/min；霧化器溫度：70 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[4-5]。

2.2 溶液制備

稱取貝母素甲、貝母素乙對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成貝母素甲和貝母素乙質(zhì)量濃度分別為1.328 g/L和1.247 g/L的混合對照品貯備液，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。取樣品適量，稱取4.003 2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加濃氨溶液5 mL，浸潤2 h，加氯仿 -乙酸乙酯 -甲醇（1∶7∶2，V/V/V）混合溶液 70 mL，置80℃水浴上加熱回流2 h，放冷，濾過；殘?jiān)曰旌先芤喝芙?，濾過，合并濾液，置100 mL容量瓶中，加混合溶液定容。精密量取續(xù)濾液50 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按杏貝止咳顆粒處方和工藝制備缺貝母的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取上述溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果陰性對照品溶液色譜在與貝母素甲和貝母素乙對照品溶液色譜相同保留時(shí)間處無干擾峰，說明本試驗(yàn)專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取混合對照品貯備液2.0，1.0，0.5，0.2，0.1 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制得系列混合對照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測對照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得貝母素甲和貝母素乙回歸方程分別為Y甲=1.468 5X甲+5.901 4，r=0.999 9（n=5），Y乙=1.469 3X乙+6.225 7，r=0.999 7（n=5）。結(jié)果表明，貝母素甲和貝母素乙進(jìn)樣量分別在0.133～2.655 μg和 0.125～2.547 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限和定量限測定：分別精密量取混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比（S/N）為10∶1和3∶1分別計(jì)算定量限和檢測限。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙定量限分別為0.132 8 μg和0.124 7 μg，檢測限分別為 0.044 26 μg 和 0.062 35 μg。

精密度試驗(yàn)：取混合對照品溶液適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)測定6次，記錄峰面積。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為0.91%和1.09%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液（批號為170721）適量，分別于室溫下放置 0，1，3，5，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣，按擬訂色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為1.23%和1.42%（n=6），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取樣品（批號為170721）適量，精密稱定，共6份，同法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙平均含量分別為每袋0.892 4 mg和1.172 6 mg，RSD分別為1.12%和1.12%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的樣品（批號為170721）適量，每份 2.0 g，共 9 份，按 80% ，100% ，120%水平分別加入混合對照品貯備液，同法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4 樣品含量測定

取樣品各適量，同法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg/袋，n=6）

3 討論

本試驗(yàn)中采用紫外-可見分光光度儀對對照品溶液進(jìn)行全波長掃描，貝母素甲和貝母素乙均無強(qiáng)發(fā)色基團(tuán)，紫外吸收很弱且為末端吸收，基線不穩(wěn)，背景干擾嚴(yán)重。而ELSD適用于無紫外吸收化合物的定量定性分析，基線平穩(wěn)，靈敏度較高。本試驗(yàn)中通過對不同比例的甲醇-水、乙腈-水及乙腈-水（含0.08%二乙胺）等流動相進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，采用乙腈-水（含0.08%二乙胺）作為流動相時(shí)，基線噪音小，分離效果良好，各色譜峰無拖尾現(xiàn)象，且分析時(shí)間較短，保留時(shí)間適中。本試驗(yàn)中在參考文獻(xiàn)[6-8]的基礎(chǔ)上，對漂移管溫度和載氣流速進(jìn)行優(yōu)化，考察了飄移管溫度為70～100℃、載氣流速為1.5～2.2 L/min時(shí)待測成分的響應(yīng)值，結(jié)果顯示，漂移管溫度為85℃、載氣流速為2.1 L/min時(shí)，響應(yīng)值最高，色譜峰峰形和分離度均良好，且不受雜質(zhì)干擾。

本試驗(yàn)中對提取溶劑、提取方法和提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化篩選，分別以氯仿、乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇（4 ∶1，V/V）、氯仿 -甲醇（4 ∶1，V/V）及氯仿 -乙酸乙酯 -甲醇（2∶7∶1，V/V/V）為提取溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，氯仿-甲醇（4∶1，V/V）和氯仿-乙酸乙酯-甲醇（2 ∶7 ∶1，V/V/V）2 種提取溶劑提取效果較好，考慮乙酸乙酯的毒性低于氯仿，故選用后者；比較了超聲、加熱回流提取2種方法的提取效果[7]，結(jié)果顯示，加熱回流提取時(shí)2種待測成分含量較高；比較了提取1，1.5，2，2.5，3 h時(shí)的提取效果，結(jié)果顯示，提取2 h后待測成分含量無明顯變化，故選擇加熱回流提取2 h；選用了50，60，70，80，90 mL 的氯仿 -乙酸乙酯 -甲醇（2∶7 ∶1，V/V/V）混合溶液進(jìn)行加熱回流提取，結(jié)果顯示，溶液量70 mL以上待測成分含量無明顯變化，故選擇70 mL混合溶液。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于杏貝止咳顆粒貝母素甲和貝母素乙的含量測定。