正交試驗(yàn)法優(yōu)選肺炎合劑提取工藝*

韋寶含，林小明，覃祖前，曾 毅，韋平原，李練忠

（廣西壯族自治區(qū)貴港市人民醫(yī)院，廣西 貴港 537100）

肺炎合劑由麻黃、虎杖、白花蛇舌草、腫節(jié)風(fēng)、魚腥草、金銀花等中藥組方，有清熱解毒、宣肺平喘、鎮(zhèn)咳化痰功效，常用于治療急慢性支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病。方中麻黃、虎杖為主藥，麻黃主要成分為鹽酸麻黃堿，虎杖主要成分為虎杖苷[1]。本試驗(yàn)中以鹽酸麻黃堿和虎杖苷含量及提取液濃縮的相對(duì)密度為評(píng)定指標(biāo)，選擇加水量、浸泡時(shí)間、提取次數(shù)、提取時(shí)間為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)[2-4]，篩選肺炎合劑的最佳提取工藝?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SSI1500型高效液相色譜儀（美國(guó)Scientific Systems Inc）；FA-2004B型電子分析天平（上海景科甜美科學(xué)儀器有限公司）；VDR-20GU型減壓干燥器（韓國(guó)杰奧特有限公司）；XO-5200TDS型超聲波清洗器（武漢恒信世紀(jì)科技有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)為171241-201007）、虎杖苷對(duì)照品（批號(hào)為111575-200502），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（批號(hào)為2017090401）、乙腈（批號(hào)為2017081401）均為色譜純，購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司；磷酸（西隴化工股份有限公司，批號(hào)為130525 1）、二正丁胺（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為20150603）、乙醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號(hào)為2017110201）均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸麻黃堿含量測(cè)定[5-9]

2.1.1 色譜條件

色譜柱：極性乙醚連接苯基鍵合硅膠（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.092% 磷酸溶液（含 0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）-甲醇（98.5∶1.5）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；室溫：28.3℃。

2.1.2 溶液制備

圖1 鹽酸麻黃堿含量測(cè)定高效液相色譜圖

取鹽酸麻黃堿對(duì)照品0.0284 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成1 mL含284 μg的對(duì)照品溶液。按1/5處方量取藥材87.9 g，加8倍量水煎煮3次，每次煎煮2 h，濾過，合并濾液，濃縮至適量放冷后定容至200 mL，搖勻，即得供試品貯備液；精密量取 2 mL，置50 mL容量瓶中，用1.44%磷酸溶液定容，稱定質(zhì)量，超聲（功率為600 W，頻率為50 kHz）處理20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用1.44%磷酸溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按供試品溶液制備方法制備缺麻黃的陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密量取2.1.2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖1。

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.4，1.6 mL，分別置 25 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻。按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）對(duì)樣品質(zhì)量濃度（X，mg/mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=9 284.2X+41 278，R2=0.999 7（n=6）。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度在4.5444～18.176μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，依法測(cè)定鹽酸麻黃堿峰面積，平行操作6次。結(jié)果的RSD為0.261%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液，室溫下按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件分別于 0，3，6，9，12，24 h 時(shí)依法進(jìn)樣測(cè)定鹽酸麻黃堿峰面積。結(jié)果的RSD為0.262%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一供試品貯備液，按供試品溶液制備方法平行制備6份，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件依法進(jìn)樣測(cè)定鹽酸麻黃堿的含量。結(jié)果平均含量為7.3267 μg/mL，RSD為0.75%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取已知含量的供試品貯備液1 mL，共6份，每?jī)煞轂橐唤M，分別精密加入對(duì)照品溶液 0.3，0.7，1.1 mL，混勻，依法制備試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣依法測(cè)定鹽酸麻黃堿含量，計(jì)算含量及回收率。結(jié)果見表1。

表1 鹽酸麻黃堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2 虎杖苷含量測(cè)定[10-14]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：ODS 膠 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -水（23∶77，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min；柱溫：45 ℃ ；室溫：26.5℃。

2.2.2 溶液制備

稱取經(jīng)五氧化二磷干燥劑減壓干燥24 h的虎杖苷對(duì)照品0.004 0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇溶解并定容，搖勻，制成對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為80 μg/mL）。按 1/5處方量取藥材 87.9 g，加 8倍量水煎煮3次，每次煎煮2 h，濾過，合并濾液，濃縮至適量，放冷后定容至200 mL，搖勻，即得供試品貯備液；精密量取2 mL置50 mL容量瓶中，用稀乙醇定容，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按供試品溶液制備方法制備不含虎杖的陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2.2項(xiàng)下3種溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定。結(jié)果理論板數(shù)按虎杖苷峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，陰性對(duì)照無干擾，詳見圖2。

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分別置 10 mL 容量瓶中，用稀乙醇定容，搖勻。按擬訂色譜條件依法測(cè)定，以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X，mg/mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=27 091X-2 312.8，R2=0.999 6（n=6）。結(jié)果表明，虎杖苷質(zhì)量濃度在4～24 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖2 虎杖苷含量測(cè)定高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定虎杖苷峰面積，平行操作6次。結(jié)果的RSD為0.77%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取供試品溶液，室溫下按擬訂2.2.1 項(xiàng)下色譜條件分別于 0，3，6，9，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣依法測(cè)定虎杖苷峰面積。結(jié)果的RSD為0.21%（n=6），表明室溫下供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一供試品貯備液，按供試品溶液制備方法平行制備6份，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣依法測(cè)定虎杖苷的含量。結(jié)果平均含量為17.1267 μg/mL，RSD為1.65%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取已知含量的供試品貯備液1 mL共6份，每?jī)煞轂橐唤M，分別精密加入對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為 400 μg/mL）0.5，1.0，1.5 mL，依法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣依法測(cè)定虎杖苷含量，計(jì)算含量及回收率。結(jié)果見表2。

表2 虎杖苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3 相對(duì)密度測(cè)定

按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》相對(duì)密度測(cè)定法（通則0601）項(xiàng)下“比重瓶法”測(cè)定各樣品溶液的相對(duì)密度，結(jié)果見表3。

2.4 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)制訂

將相對(duì)密度（X）的考核滿分定為20分，鹽酸麻黃堿含量（Y）、虎杖苷含量（Z）的考核滿分均定為40分。即綜合評(píng)分計(jì)算公式為：總分=（Xi/Xmax）×20+（Yi/Ymax）×40+ （Zi/Zmax）×40（i介于 1～9）。

表 3 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)選

因素與水平：選取加水量（A，倍）、浸泡時(shí)間（B，min）、提取時(shí)間（C，h）、提取次數(shù)（D，次）為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，見表4。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法：稱取1/5處方量藥材，按表2、表 3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)。提取液過濾，合并提取液濃縮至適量，放冷后用水定容至200 mL，搖勻，即得9個(gè)試驗(yàn)樣品溶液。依法測(cè)定鹽酸麻黃堿和虎杖苷含量及溶液相對(duì)密度。結(jié)果見表3。

結(jié)果分析：由表3直觀分析結(jié)果可知，各因素影響程度為 D>B>A>C，其中，因素 A：A3>A1>A2，因素 B：B3>B2>B1，因素 C：C3>C1>C2，因素 D：D3>D2>D1，因此選用提取工藝為A3B3C3D3。由表5方差分析結(jié)果可知，因素D對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有極顯著影響，因素B對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，因素A及因素C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果幾乎無影響。

表5 方差分析結(jié)果

最佳工藝確定：利用直觀分析法分析正交試驗(yàn)結(jié)果后，由于所得最佳搭配只是相對(duì)于被選因素和水平而言，不是絕對(duì)的“最佳”，因此通常需作進(jìn)一步討論，而這一點(diǎn)恰恰容易被研究人員忽視[15]。綜合表3和表5及從降低能源消耗和生產(chǎn)成本考慮，優(yōu)選提取工藝的最佳條件為A1B3C1D3，即加8倍量水，浸泡90/120 min，每次提取1 h，共提取3次，此為肺炎合劑的最佳提取工藝。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方量比例平行稱取藥材3份，分別按A1B3C1D3提取工藝操作，依法測(cè)定鹽酸麻黃堿、虎杖苷的含量及溶液相對(duì)密度。結(jié)果見表6?？梢?，3份提取液的綜合評(píng)分分別為101.30，101.31，100.51分，均高于表3的最高評(píng)分。說明該提取工藝科學(xué)合理，穩(wěn)定可行。

表6 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 測(cè)定方法選擇

含量測(cè)定成分選擇：一般應(yīng)根據(jù)制劑的功能主治或活性試驗(yàn)結(jié)果來選擇相應(yīng)的專屬性成分、活性成分作為含量測(cè)定指標(biāo)，同時(shí)應(yīng)首選樣品中原含成分，避免選用水解成分。當(dāng)單一成分不能反映該藥的整體活性時(shí)，應(yīng)采用多成分或多組分的檢測(cè)方法。麻黃和虎杖作為肺炎合劑主藥，鹽酸麻黃堿和虎杖苷作為主要成分，被2015年版《中國(guó)藥典（一部）》收載為麻黃和虎杖的定量指標(biāo)，本研究中選擇鹽酸麻黃堿和虎杖苷作為定量指標(biāo)具有重要意義。

流動(dòng)相選擇：虎杖苷含量測(cè)定試驗(yàn)中，比較了流動(dòng)相為乙腈 -水（20 ∶80，V/V）、乙腈-水（23 ∶77，V/V）、乙腈-水（30∶70，V/V）時(shí)對(duì)分離結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水（23∶77，V/V）的分離效果最好。鹽酸麻黃堿含量測(cè)定試驗(yàn)中，比較了流動(dòng)相為0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）-甲醇（98.5∶1.5，V/V）和（98 ∶2，V/V）對(duì)分離結(jié)果的影響，結(jié)果分離效果基本一致。

避光操作：試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，虎杖苷需在避光下操作，否則在光照條件下易分解，含量下降明顯[16-17]。

3.2 提取工藝選擇

加水量：加水量為8，10，12倍時(shí)，綜合評(píng)分（3個(gè)樣品之和，下同）分別為 206.06，187.59，225.40 分（P>0.05）。結(jié)果顯示，加水量在8～12倍之間時(shí)對(duì)制劑質(zhì)量影響甚微，但8倍加水量更節(jié)約資源，成本更低。因此，加水量選擇8倍。

浸泡時(shí)間：浸泡時(shí)間分別為30/60，60/90，90/120 min 時(shí)，綜合評(píng)分分別為 176.65，209.41，232.98 分（P<0.05）。結(jié)果表明，浸泡時(shí)間對(duì)制劑質(zhì)量有一定影響。故浸泡時(shí)間選擇綜合評(píng)分最高的B3，即浸泡時(shí)間選擇90/120 min。

提取時(shí)間：提取時(shí)間為1，1.5，2 h時(shí)，綜合評(píng)分分別為210.85，197.33，210.86分，說明提取時(shí)間在1～2 h范圍內(nèi)時(shí)對(duì)制劑質(zhì)量幾乎無影響，從節(jié)約能源和生產(chǎn)成本考慮，提取時(shí)間選擇1 h。

提取次數(shù)：提取次數(shù)分別為1，2，3次時(shí)，綜合評(píng)分分別為 143.90，219.52，255.62 分（P<0.05）。結(jié)果表明，提取次數(shù)對(duì)制劑質(zhì)量有顯著影響，在1～3次范圍內(nèi)提取次數(shù)越多，制劑有效成分含量越高，故提取次數(shù)選擇3次。

綜上所述，高效液相色譜法測(cè)定肺炎合劑提取液中鹽酸麻黃堿、虎杖苷的含量，專屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。最佳提取工藝條件為加水8倍，浸泡90/120 min，每次提取1 h，提取3次。此提取工藝經(jīng)驗(yàn)證證明科學(xué)合理，穩(wěn)定可行。