冬季鳳眼蓮對(duì)鹽脅迫的鹽害表現(xiàn)及生理響應(yīng)

周丁陽，徐娜娜，朱旭輝，徐嘉俊，盛建龍，王子豪

(浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022)

鳳眼蓮Eichhornia crassipes (Mart.) Solms，是一種大型漂浮水生植物，喜高溫濕潤環(huán)境，是世界上生長繁殖速率極快，產(chǎn)量極高的水生植物之一。雖然被列為世界十大惡性雜草之一[1]，但因其對(duì)水體污染物較強(qiáng)的吸收積累與分解轉(zhuǎn)化能力，被成功應(yīng)用于處理各類廢水并在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的認(rèn)可[2-3]。在25～35℃溫度中，8 個(gè)月內(nèi)能從10 株增長到80 萬株，繁殖能力極強(qiáng)[4]。鳳眼蓮自1911年引入浙江省杭嘉湖平原后，現(xiàn)已廣泛分布于我國19 個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)，在長三角、珠三角地區(qū)河流湖泊等淡水水域泛濫成災(zāi)[5-6]，環(huán)境適應(yīng)力驚人，但是對(duì)于鳳眼蓮在咸水或半咸水中自然生長的案例目前還未有報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，鳳眼蓮在鹽度為10 的灘涂養(yǎng)殖廢水中能較好的生長并吸收大量營養(yǎng)鹽[7]，說明其具有一定的耐鹽力。然而，目前對(duì)鳳眼蓮的研究多集中在探討其對(duì)水體氮、磷、重金屬、有機(jī)污染物等的去除效果以及在污染水體中的響應(yīng)機(jī)制[8-11]，未見有關(guān)鹽脅迫的報(bào)道。此外，鳳眼蓮為多年生水生植物，性喜溫暖，在高溫環(huán)境中生命力旺盛，但抗寒能力較弱[12]，一般可耐低溫5℃，當(dāng)氣溫13℃或水溫10℃以上才開始生長[13]。它在低溫脅迫下葉片細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)大量外滲，質(zhì)膜透性增加[12]，會(huì)造成生理干旱和有毒物質(zhì)積累[14]，因而有學(xué)者關(guān)注不同溫度下鳳眼蓮的污水凈化能力[15]。所以本試驗(yàn)在冬季研究鳳眼蓮對(duì)鹽脅迫的鹽害表現(xiàn)及生理響應(yīng)將有更實(shí)際的應(yīng)用意義。

試驗(yàn)在冬季開展，模擬不同鹽脅迫環(huán)境，以鳳眼蓮葉的鹽害表現(xiàn)，細(xì)胞膜膜脂過氧化反應(yīng)、抗氧化酶活性以及滲透調(diào)節(jié)的生理響應(yīng)來探討鳳眼蓮的適應(yīng)性情況，以期獲得植物在舟山冬季的溫度條件下最高耐受的鹽度范圍，為鳳眼蓮修復(fù)河口、內(nèi)陸咸水湖等污染水體的工程應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鳳眼蓮在舟山市溫度條件(季風(fēng)明顯，年平均氣溫16.7℃，冬季平均7.0℃)自然生長，植物于2017年11月19 日采回，通過除雜清洗挑選，在室外PVC 大棚(透光率為85%～93%)內(nèi)保持自然光照(午間光強(qiáng)為904.5～12 400 lx)，于PP 材質(zhì)48 L 方形透明儲(chǔ)物箱(長55 cm×寬39 cm×高31 cm) 中使用標(biāo)準(zhǔn)配比的Hoagland 完全營養(yǎng)液(北京溪青青農(nóng)業(yè)科技有限公司)中馴化2 周，馴化時(shí)氣溫為8.8～18.3℃，濕度為46%～96%，植株均長勢(shì)良好。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017年12月3 日在標(biāo)準(zhǔn)配比的Hoagland 完全營養(yǎng)液中添加海鹽(廣州益爾生物工程有限公司)，設(shè)置5、10、14、18、21 的鹽度梯度，以不添加海鹽為對(duì)照(實(shí)測(cè)培養(yǎng)液鹽度為1‰)，每個(gè)鹽度梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，共18 個(gè)培養(yǎng)單元。每個(gè)培養(yǎng)單元挑選株型相近、健壯、鮮重185.12±9.28 g 的鳳眼蓮用于鹽脅迫試驗(yàn)，培養(yǎng)11 d，試驗(yàn)時(shí)氣溫為4～16.5℃，濕度為45%～94%。每天使用便攜式pH 計(jì)電導(dǎo)率儀溶氧儀(AZ8603)測(cè)量培養(yǎng)水的水溫、pH、DO 和鹽度，并補(bǔ)充蒸發(fā)水分保證鹽度條件，觀察測(cè)量記錄鳳眼蓮葉的鹽害表現(xiàn)。11 d 后，各個(gè)培養(yǎng)單元稱取0.3 g 左右的葉片用于生理生化指標(biāo)測(cè)定。

1.3 鹽害表現(xiàn)觀察

根據(jù)鳳眼蓮葉的鹽害表現(xiàn)，將鹽害分級(jí)[16]劃分為5 級(jí)，包括0 級(jí)，生長正常，葉片無傷斑無卷曲，且葉柄無鹽害癥狀(圖1A)；1 級(jí)，輕度鹽害，葉片傷斑或卷曲枯黃面積＜25%(圖1B)；2 級(jí)，中度鹽害，葉片傷斑或卷曲枯黃面積在25%～50%之間(圖1C)，或葉柄有膨壓降低，稍變軟保持直立；3 級(jí)，重度鹽害，葉片傷斑或卷曲枯黃面積在50%～75%之間(圖1D)；4 級(jí)，極重度鹽害，葉片傷斑或卷曲枯黃面積＞75%(圖1E)，或葉柄嚴(yán)重膨壓降低軟化并且倒伏(圖1F)。最后，根據(jù)如下公式[16]計(jì)算鹽害指數(shù)(salt injury index，SI)。

圖1 5 個(gè)鹽害等級(jí)鳳眼蓮葉的形態(tài)特征Fig.1 Leaf morphological characteristics of E.crassipes on five salt injury levels respectively

1.4 相對(duì)生長速率計(jì)算

用電子天平(精度0.01 g)在試驗(yàn)開始及試驗(yàn)結(jié)束分別測(cè)得各組鳳眼蓮植株的鮮重，根據(jù)如下公式[17]計(jì)算相對(duì)生長速率(relative growth rate，RGR)。

1.5 生理生化指標(biāo)測(cè)定

使用南京建成生物研究所的試劑盒，丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法、脯氨酸(Pro)采用酸性茚三酮比色法、超氧化物歧化酶(SOD)采用羥胺法、過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚法，測(cè)定鳳眼蓮葉片中氧化逆境產(chǎn)物和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量以及抗氧化酶活性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD 多重比較，方差不齊時(shí)用非參數(shù)的kruskal-wallis H 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同鹽脅迫下鳳眼蓮的生長變化

2.1.1 鹽害指數(shù)(SI)

對(duì)照組在5～7 d 出現(xiàn)鹽害表現(xiàn)(表1)，之后平緩，結(jié)束時(shí)的SI 為21.5%±2.2%，顯著低于各鹽處理組(P＜0.05)，有輕度鹽害特征；5 的SI 在第4～6 天上升較快，結(jié)束時(shí)各個(gè)鹽害級(jí)別特征的葉均有出現(xiàn)，SI 為45.0%±4.9%，顯著低于高鹽度組(P＜0.05)；10 的SI 逐步升高，在試驗(yàn)最后一天有平緩的趨勢(shì)，達(dá)到72.4%±4.7%，有半數(shù)以上葉達(dá)到3 或4 級(jí)鹽害特征，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組、5 和10 的SI 呈顯著線性遞增(R2=0.974，P＜0.01)；14、18 和21 的SI 在試驗(yàn)1 d 時(shí)迅速上升到52.0%±6.3%、79.2%±2.1%和80.7%±6.6%，培養(yǎng)11 d 后鹽害表現(xiàn)明顯，SI 均達(dá)到90%以上，且三者第10 d 開始無顯著性差異。

表1 不同鹽脅迫下鹽害指數(shù)隨時(shí)間的變化Tab.1 Changes of SI with time under different salt stress

2.1.2 鮮重及株數(shù)

試驗(yàn)開始時(shí)各組鮮重及株數(shù)均無顯著性差異(表2)。培養(yǎng)11 d 后，RGR 除對(duì)照組為0.52%±0.27%，鹽脅迫處理組均為負(fù)值，10 及更高鹽度與對(duì)照均存在差異性(P＜0.05)，其中10 的RGR 最低，為-0.90%±0.20%。對(duì)照組、5、10 的RGR 呈現(xiàn)顯著的線性遞減(R2=0.779，P=0.002)。

表2 不同鹽脅迫下鮮重及株數(shù)變化Tab.2 Changes of fresh weight and the number of plants under different salt stress

2.2 不同鹽脅迫下鳳眼蓮的生理響應(yīng)

2.2.1 SOD 與POD 活性以及MDA 含量

鳳眼蓮葉片的SOD 活性表現(xiàn)出隨鹽度增加而增加的趨勢(shì)(圖3A)，并且均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。對(duì)照組SOD 為1 156.46±21.20 U·g-1，在14 下SOD 活性最高，為1 245.76±0.97 U·g-1。

隨著鹽度的升高，鳳眼蓮葉片的POD 活性表現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)(圖3B)，在鹽度14 下POD 活性達(dá)到最高，為340.33±11.24 U·g-1，是對(duì)照組的1.27 倍；而21 的POD 活性最低，下降至244.33±21.08 U·g-1，為對(duì)照組的0.91 倍。非參數(shù)kruskal-wallis H 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽處理組鳳眼蓮葉片的POD 活性與對(duì)照組不存在顯著性差異。

在不同鹽脅迫下，鳳眼蓮葉片的MDA 含量積累不同(圖3C)，其中10 的MDA 含量最高，達(dá)到41.4±3.87 nmol·g-1，為對(duì)照組的1.44 倍，顯著高于對(duì)照組以及5、14 和18(P＜0.05)。對(duì)照組、5 和10 下葉片MDA含量隨鹽度增高呈顯著線性增加(R2=0.615，P=0.012)。

2.2.2 Pro 含量

鹽度從對(duì)照組逐級(jí)到10，鹽脅迫逐漸加大，鳳眼蓮葉片中的Pro 含量也隨之逐級(jí)升高(圖3D)，并且3個(gè)鹽度之間存在顯著性差異(P＜0.05)，葉片Pro 含量沿鹽度增加而線性遞增(R2=0.884，P＜0.01)。Pro 含量在10 達(dá)到最高的57.07±9.20 μg·g-1，為對(duì)照組的2.63 倍，但當(dāng)鹽度繼續(xù)升高反而有下降趨勢(shì)，21 的含量為46.76±6.22 μg·g-1。

圖3 不同鹽脅迫下SOD 和POD 的活性以及MDA 和Pro 的含量Fig.3 Activities of SOD，POD and content of MDA，Pro under different salt stress

3 討論

3.1 鹽脅迫對(duì)鳳眼蓮葉的形態(tài)損害

試驗(yàn)期間多次受到冷空氣影響[18]，對(duì)照組鳳眼蓮因低溫脅迫，部分葉片表現(xiàn)為外緣枯黃的特征[19]。鹽脅迫引起植物的水分虧缺以及離子毒害，處理組均出現(xiàn)不同程度的鹽害特征。5 的植株在脅迫開始后部分葉片外緣略微卷曲，出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，受損部分之后逐漸枯黃，頂生幼葉始終保持健康狀態(tài)。其SI 在4～7 d也快速升高，說明同期也受到了低溫的影響。最后數(shù)據(jù)趨于穩(wěn)定表明鳳眼蓮?fù)ㄟ^自我調(diào)節(jié)已經(jīng)適應(yīng)了5 的鹽度環(huán)境。10 的鳳眼蓮在脅迫開始后大量葉片脫水卷曲，之后外緣逐漸枯黃，試驗(yàn)8 d 后植株無健康葉片，而葉柄的鹽害表現(xiàn)不明顯。葉片的非正常衰老說明鳳眼蓮在10 的鹽脅迫下表現(xiàn)出犧牲局部來維系生命的被動(dòng)適應(yīng)策略[20]。葉片的脫水使得植株鮮重大量減少，只有當(dāng)其通過自我調(diào)整，水勢(shì)下降到與環(huán)境相同或更低時(shí)，才能從外界環(huán)境吸收水分以維持生命活動(dòng)[21]，其SI 在最后2 天趨向平緩可能是這個(gè)原因。

而在14、18 和21 的嚴(yán)重脅迫環(huán)境中，脅迫開始后鳳眼蓮葉柄與高鹽水體接觸，巨大的水勢(shì)可能造成了其嚴(yán)重的傷害，引起膨壓下降無法支撐葉片重量而倒伏[22]，SI 快速升高，在后續(xù)的觀察中發(fā)現(xiàn)，這種葉柄的損傷是不可逆的。葉緣出現(xiàn)大量傷斑，表現(xiàn)為失綠，泛白的特征，之后枯黃且傷害面積逐漸增大。相比之下，前期10 葉片失水卷曲得更厲害，可能是由于鳳眼蓮需要葉片通過通氣組織向下傳輸氧氣，供根系呼吸和根區(qū)的脫毒作用[23]，而根系又處在水分脅迫中無法向上供水，由于蒸騰作用失水卷曲。在14 及以上的脅迫中葉柄的損傷阻斷了氣體通道，蒸騰作用相對(duì)較弱，但氣體代謝不暢會(huì)致使植株衰退[23]，葉片與根系失去了根冠通訊[24]，后期會(huì)更快地衰老死亡，這與之后的觀察相符。SI 在14 下的不斷升高表明了冬季鳳眼蓮無法在該鹽度的水環(huán)境中生存。

3.2 鹽脅迫對(duì)鳳眼蓮生理的影響

植物在逆境下遭受傷害會(huì)發(fā)生膜脂過氧化作用，MDA 是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物[25-26]。隨著鹽度的升高，鳳眼蓮受到的脅迫壓力增大，其逆境氧化產(chǎn)物積累增多，但是到14 的水環(huán)境中MDA 含量卻有一個(gè)顯著的降低，結(jié)合鳳眼蓮的形態(tài)變化，其14、18、21 下的植株在試驗(yàn)1 d 后就出現(xiàn)大量葉柄膨壓降低，軟化倒伏的現(xiàn)象，加速葉片的衰老死亡，導(dǎo)致MDA 含量反而降低，有研究也發(fā)現(xiàn)在脅迫超過植物耐受極限時(shí)MDA含量下降的結(jié)果[27]。表明到鹽度14 時(shí)，鳳眼蓮的葉柄就無法耐受鹽脅迫而引起大量死亡。

植物在逆境條件下，體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的啟動(dòng)以清除過多的ROS，減緩植物所受傷害[20，28]。鳳眼蓮在5 時(shí)即受到了脅迫壓力，SOD 活性顯著增強(qiáng)以加快清除體內(nèi)產(chǎn)生的ROS，維持細(xì)胞的正常生命活動(dòng)[25，29]。說明在冬季的環(huán)境下，鳳眼蓮葉片的SOD 活性對(duì)水體鹽度比較敏感。而到10‰以后，SOD 活性保持在一個(gè)較高水平不再升高，這可能是因?yàn)镾OD 已經(jīng)達(dá)到了其最高的酶活性。POD 也是植物抵抗外界脅迫重要保護(hù)酶之一[30]。鳳眼蓮葉片的POD 活性在6 個(gè)鹽度條件下不存在顯著差異，這可能是由于低溫脅迫抑制了酶活性[12]，POD 對(duì)鹽度的升高不再敏感。

鳳眼蓮在高鹽環(huán)境下處于生理干旱狀態(tài)會(huì)大量合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來保持自身較低的水勢(shì)[21，31]，在鹽濃度未達(dá)到損傷植物生長的前提下其葉組織Pro 的響應(yīng)能反映植株受鹽脅迫的相對(duì)程度[32]。當(dāng)水環(huán)境從對(duì)照組到10 的變化中，鳳眼蓮葉片中的Pro 含量也隨之逐級(jí)顯著升高，并且存在較好的線性關(guān)系，這說明植株受到鹽脅迫的相對(duì)程度在逐漸提高。有研究認(rèn)為Pro 不僅能提高植物的滲透壓，還能提升植物抗氧化劑的活性[33]。而當(dāng)鹽度繼續(xù)升高時(shí)，Pro 含量反而有些降低，這表明到10 條件時(shí)鳳眼蓮可能已經(jīng)達(dá)到了Pro含量積累的最高值，并且當(dāng)鹽度繼續(xù)升高，脅迫強(qiáng)度超過了植株的耐受范圍，細(xì)胞無法維持Pro 的合成工作，最終也會(huì)導(dǎo)致鳳眼蓮的死亡[34]。Pro 含量的結(jié)果也表明鳳眼蓮無法適應(yīng)鹽度14 的水環(huán)境。

通過Pearson 相關(guān)性分析(表3)，植物體內(nèi)SOD 酶活性、Pro 含量變化與水體鹽度三者之間均呈極顯著正相關(guān)變化(P＜0.01)，這表明冬季鳳眼蓮對(duì)鹽脅迫的生理相應(yīng)中，SOD 酶活性的提高以及Pro 的合成積累對(duì)植物的抗逆性起著重要作用。

表3 鹽度和植物生理生化指標(biāo)的Pearson 相關(guān)性分析Tab.3 Pearson conclusion of the physiological indexes and salinity

綜上所述，在舟山冬季溫度條件下，鳳眼蓮在5 和10 的鹽脅迫中以葉片的形態(tài)損傷為主，當(dāng)鹽度達(dá)到14 及更高其葉柄會(huì)失水倒伏。葉片中MDA 含量增多，植物表現(xiàn)出SOD 活性顯著提高，積累Pro 等的應(yīng)對(duì)策略，其中Pro 含量對(duì)SOD 活性呈正相關(guān)性，但當(dāng)鹽脅迫超過植物耐受極限(本試驗(yàn)中為14)時(shí)MDA 含量下降。而POD 活性受到低溫抑制，對(duì)鹽脅迫不敏感。鳳眼蓮自我調(diào)節(jié)能力有限，冬季可耐受的最高鹽度可能在10～14 之間。