重組玉米赤霉烯酮酶ZENC降解麩皮毒素的條件優(yōu)化

畢 可， 馬 成， 王文博， 肖志壯， 張大偉

（1.生物工程學(xué)院，齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東濟(jì)南250353；2.青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司，山東青島266111）

玉米赤霉烯酮是一種雌激素類霉菌毒素，又稱F-2毒素，其從發(fā)霉玉米上的赤霉菌中首次分離得到并于1966年由Urry等確定了其分子結(jié)構(gòu)（Urry等，1966）。玉米、小麥、水稻等多種糧食作物均會不同程度的受到玉米赤霉烯酮的污染，動物攝入玉米赤霉烯酮污染的飼料后，會出現(xiàn)一系列生殖異?，F(xiàn)象，如死胎、流產(chǎn)、幼崽體重下降等，降低了動物的生殖能力（Zinedine等，2007）。利用改性蒙脫石等礦物質(zhì)的物理吸附作用，是目前飼料加工中降低霉菌毒素毒副作用的主要手段，但由于玉米赤霉烯酮分子的極性較小，物理吸附去除率較低。

相對于傳統(tǒng)的物理吸附法，酶解方法具有降解條件溫和，作用專一性強(qiáng)等特點(diǎn)，并且能夠在降解玉米赤霉烯酮的同時保留飼料原有營養(yǎng)價值（成博倫等，2015）。Takahashi-Ando等（2002）篩選到一株粉紅螺旋聚孢霉 （Clonostachys rosea）IFO7063可以將ZEN完全轉(zhuǎn)化為沒有雌激素活性的代謝產(chǎn)物，并成功獲得了降解酶ZHD101。程波財?shù)龋?010）成功在重組畢赤酵母中表達(dá)了與ZHD101高度同源的玉米赤霉烯酮降解酶，可水解玉米赤霉烯酮12-C的酯鍵，破壞玉米赤霉烯酮的結(jié)構(gòu)，降低玉米赤霉烯酮與雌激素受體的結(jié)合能力。研究表明，在重組畢赤酵母中也成功表達(dá)了來源于粗糙鏈孢霉的酯水解酶ZENC，對玉米赤霉烯酮的降解途徑與ZHD相同，酶活pH為6.0～9.5，溫度為20～50℃（程波財?shù)龋?010）。

麩皮是面粉加工生產(chǎn)的副產(chǎn)物，也是一類常用的飼料原料，但霉菌毒素含量較高。發(fā)酵麩皮是乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的一類發(fā)酵飼料，可改善動物腸道健康，降低畜舍氨臭。本研究采用三因素三水平正交試驗(yàn)，對pH、水分和時間等因素對毒素降解的效果進(jìn)行測定，探索ZENC降解麩皮中玉米赤霉烯酮的應(yīng)用方案。同時，在發(fā)酵麩皮生產(chǎn)中，也試驗(yàn)了ZENC與不同劑型發(fā)酵劑聯(lián)用的效果，以期對發(fā)酵飼料的生產(chǎn)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 玉米赤霉烯酮降解酶ZENC來自青島根源生物集團(tuán)。麩皮購自市場，選取其中玉米赤霉烯酮含量較高者進(jìn)行試驗(yàn)。玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品購自ROMER Labs（奧地利)，常用試劑購自生工生物（上海）。

1.2 麩皮粉處理 用高速粉碎機(jī)（＞12000 r/min）將麩皮打成粉狀，然后過2 mm篩。稱取制好的麩皮粉500 g，分別裝入自封袋中備用。

1.3 麩皮粉pH測定和調(diào)節(jié) 向10 g麩皮粉中加入50 mL蒸餾水，測得pH為4.23。分別向500 g麩皮粉中加入NaOH 5.6、6.0、6.3 g，調(diào)節(jié)pH至6.0、6.5、7.0。

1.4 飼料中玉米赤霉烯酮分析方法

1.4.1 玉米赤霉烯酮提取 參照GB 5009.209-2016食品中玉米赤霉烯酮測定中的采樣方法，稱取40 g待測樣品（固體樣品需粉碎，并過2 mm分樣篩），向其中加入100 mL 80%乙腈水溶液（V/V）?；旌弦航?jīng)高速勻質(zhì)器（＞12000 r/min）處理1 min，使其充分混合。充分混合后用快速定性濾紙過濾，收集濾液。取10 mL濾液加入40 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋，再用玻璃纖維濾紙過濾，并收集濾液。

1.4.2 玉米赤霉烯酮凈化 取上一步驟中濾液10 mL，使用玉米赤霉烯酮免疫親和柱對其凈化，試劑盒購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.4.3 玉米赤霉烯酮檢測方法 使用高效液相色譜法檢測凈化后液體中玉米赤霉烯酮峰面積，根據(jù)玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品峰面積計算其玉米赤霉烯酮含量。

色譜條件：C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm)，流動相：乙腈：甲醇：水=46：8：46（V/V/V)，流速：0.8 mL/min，熒光檢測：激發(fā)和檢測波長分別為274 nm和440 nm。

1.5 不同降解條件組合對玉米赤霉烯酮降解酶降解效果的影響 設(shè)計三因素三水平正交試驗(yàn)，分別是時間（4、8、24 h）、pH（6.0、6.5、7.0）、含水量（30%、40%、50%）。分別稱取500 g麩皮粉裝入自封袋中，加入所需量的NaOH溶液，將麩皮粉的pH調(diào)整到試驗(yàn)條件所需；加入ZENC，酶活單位為7000 U（1 U=1 min降解1μg玉米赤霉烯酮）；再加入適量的蒸餾水獲得試驗(yàn)需要的含水量，揉捏自封袋以充分混勻?；靹蚝髮⒆苑獯湃?0℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行酶解，在降解4、8、24、48 h時分別取出125 g放入冰箱中，待48 h后將所有樣品取出。然后將樣品分別放入鋁槽平鋪開，放入80℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干。每種因素組合做三組平行試驗(yàn)。對照組中添加經(jīng)高溫滅活的降解酶，其余條件與試驗(yàn)組相同。

將烘干后的麩皮粉放入高速粉碎機(jī)（＞12000 r/min）粉碎成細(xì)末，提取其中的玉米赤霉烯酮檢測其含量，數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0分析統(tǒng)計。

1.6 ZENC在發(fā)酵麩皮中的應(yīng)用 各組稱取500 g麩皮，加入蒸餾水和發(fā)酵劑，使最終含水量均為42%，各組發(fā)酵劑配方如表1所示，充分混合后在35℃進(jìn)行發(fā)酵，分別測定發(fā)酵0、8、48 h后玉米赤霉烯酮含量。

表1 發(fā)酵劑和毒素降解酶添加配方

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米赤霉烯酮酶解條件的正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，表2極差分析結(jié)果表明，當(dāng)降解條件為pH 6.5、含水量50%、處理時間24 h時是最優(yōu)條件，玉米赤霉烯酮降解酶對麩皮粉中的玉米赤霉烯酮降解效果最好。方差分析結(jié)果顯示，處理時間F比＞F0.01＞pH，F(xiàn)比＞含水量F比＞F0.05＞F0.1，說明三種因素的水平改變對降解效果均有顯著影響，其中處理時間的改變對玉米赤霉烯酮降解酶降解玉米赤霉烯酮的效果具有極顯著的影響。

如圖1所示，當(dāng)試驗(yàn)條件為最優(yōu)降解條件：pH 6.5、麩皮粉含水量50%、處理時間24 h時，降解后的麩皮粉中玉米赤霉烯酮含量為（203.45±6.25）μg/kg，遠(yuǎn)低于國家限定含量，玉米赤霉烯酮降解率為87.29%。

表2 三因素三水平正交試驗(yàn)結(jié)果

圖1 最優(yōu)條件下降解麩皮粉中玉米赤霉烯酮效果曲線圖

2.2 ZENC在發(fā)酵麩皮中的應(yīng)用結(jié)果 發(fā)酵前麩皮中玉米赤霉烯酮含量為1600μg/kg,降解后發(fā)酵麩皮中玉米赤霉烯酮含量如圖2所示。

圖2 玉米赤霉烯酮降解酶與乳酸桿菌復(fù)合使用對麩皮中玉米赤霉烯酮降解效果柱狀圖

發(fā)酵0 h時，復(fù)合使用試驗(yàn)組較對照組玉米赤霉烯酮含量低，說明在混合過程中，毒素的降解已經(jīng)開始進(jìn)行；發(fā)酵8 h后所有試驗(yàn)組中玉米赤霉烯酮含量均有下降，植物乳桿菌菌粉+酶組降解效果最好，其降解率可達(dá)51%，而乳酸菌發(fā)酵液+酶組降解率為18%；發(fā)酵48 h后玉米赤霉烯酮含量較發(fā)酵8 h略有下降，乳酸菌發(fā)酵液+酶組降解率僅為20.8%，植物乳桿菌菌粉+酶組降解率為53.4%。

ZENC酶學(xué)性質(zhì)顯示，其酶活pH為6.0～9.0，試驗(yàn)-1組（乳酸菌發(fā)酵液+酶）發(fā)酵0、8、48 h的樣品pH分別為5.45、4.71、4.45，而試驗(yàn)-2組（植物乳桿菌菌粉+酶）在相應(yīng)時間樣品的pH分別為6.35、5.57、4.48，環(huán)境pH差異可能是導(dǎo)致毒素降解率不同的主要原因。在發(fā)酵麩皮的生產(chǎn)中，與乳酸菌菌粉聯(lián)用，ZENC降解毒素的效果好于與乳酸菌發(fā)酵液聯(lián)用。

3 討論

按照國家GB 13078-2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（新版）》對玉米赤霉烯酮允許量的規(guī)定，配合飼料和玉米及其加工產(chǎn)品中玉米赤霉烯酮的含量不得超過500μg/kg。我國對飼料原料中玉米赤霉烯酮的限量要求相較于對成品飼料中的含量要求較寬，對成品飼料中的玉米赤霉烯酮含量要求小于500μg/kg，其他豬配合飼料玉米赤霉烯酮含量小于250μg/kg。研究發(fā)現(xiàn)，我國飼料原料中的玉米赤霉烯酮檢出率較高，超標(biāo)率達(dá)10%（程傳民等,2014)。利用降解途徑明確的赤霉烯酮降解酶，優(yōu)化對毒素的生物降解條件，有助于保證飼料品質(zhì)的安全。

玉米赤霉烯酮生物降解法近幾年來得到了較快發(fā)展，已有研究表明，多種微生物可以有效降解玉米赤霉烯酮。Fu等（2016）得到一株地衣芽孢桿菌CK1，在喂食給母豬后能夠有效降低玉米赤霉烯酮對母豬產(chǎn)生的雌激素作用。Lei等（2014）篩選出1株枯草芽孢桿菌ANSB01G,在液體培養(yǎng)基中對ZEN降解率為88.65%,并且該菌能夠降解自然霉變玉米，DDGS和豬配合飼料中的玉米赤霉烯酮。微生物的細(xì)胞壁對玉米赤霉烯酮也具有吸收作用（Keller等，2015），這解釋了對照組雖然沒有添加降解酶但其中的玉米赤霉烯酮含量仍然降低的現(xiàn)象。

目前，多種微生物來源的酯水解酶，對玉米赤霉烯酮的降解途徑得到明確闡述，酶降解法可以直接作用于玉米赤霉烯酮分子本身，改變玉米赤霉烯酮的分子結(jié)構(gòu)使其不再具有原有的生理毒性，同時，酶解處理毒素，對原料的營養(yǎng)構(gòu)成影響小。發(fā)酵麩皮是一類新興的發(fā)酵飼料，在發(fā)酵麩皮的生產(chǎn)中，添加適量毒素降解酶與發(fā)酵劑聯(lián)用，不但可有效降解毒素，而且可降低生產(chǎn)成本。

4 結(jié)論

本研究采用酶降解法，通過設(shè)計三因素三水平正交試驗(yàn)獲得了玉米赤霉烯酮降解酶最優(yōu)降解條件，即當(dāng)麩皮粉含水量為50%，pH為6.5，用玉米赤霉烯酮降解酶降解處理24 h時可以得到最優(yōu)降解效果，玉米赤霉烯酮降解率達(dá)87.29%。在發(fā)酵麩皮的生產(chǎn)中，植物乳桿菌菌粉與ZENC聯(lián)用，發(fā)酵48 h后，玉米赤霉烯酮降解率達(dá)到53.4%。本研究結(jié)果對麩皮等飼料原料的霉菌毒素降解提供一定依據(jù)，有助于提升飼料原料的品質(zhì)。