高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定漁業(yè)水體及漁業(yè)飼料中的五氯苯酚

萬譯文， 黃向榮*， 伍遠(yuǎn)安， 李小玲， 肖 維， 楊 霄

（1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長沙410153；2.水產(chǎn)健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德415000；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，湖南長沙410153）

五氯苯酚（PCP）簡稱五氯酚，是一種毒性較強(qiáng)的氯代酚類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易降解，通過食物鏈進(jìn)入人體后富集，可造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝腎損傷及內(nèi)分泌紊亂（譚渝云，1996）。五氯苯酚曾在我國南方血吸蟲病疫區(qū)被作為滅螺藥而大量的使用，也有漁民使用五氯苯酚在清塘過程中滅殺雜魚，因此五氯苯酚在水體和環(huán)境中殘留還會持續(xù)很長一段時(shí)間，環(huán)境中殘留的五氯苯酚依然會富集到生物體內(nèi)。

目前已報(bào)道的五氯酚檢測方法有：分光光度法（榮寶晶和崔楊卓，2005）、免疫法（Noguera等，2002）、氣相色譜法（胡博等，2015；端禮欽等，2011）、液相色譜法（廖林川等，2004）、氣相色譜-質(zhì)譜法（史玉坤等，2015）。氣相色譜法是各類物質(zhì)中五氯苯酚檢測的常用分析方法，由于五氯苯酚沸點(diǎn)高，難于汽化，因此需要進(jìn)行衍生化處理后才能上機(jī)檢測，而在衍生的過程中，對衍生溫度、衍生時(shí)間、pH、反應(yīng)時(shí)間等有較高的要求，因此，重現(xiàn)性差且回收率不高。本文旨在建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定漁業(yè)水體及漁業(yè)飼料中五氯酚的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于98.9%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、二氯甲烷、甲醇、甲酸（色譜純），德國Merk公司；乙酸銨（色譜純），美國天地公司；Oasis HLB（6 mL/500 mg），美國waters公司；Oasis MAX（6 mL/500 mg），美國waters公司；超純水，美國Milli-Q純水系統(tǒng)制水。

1.2 儀器與設(shè)備 TSQ高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo公司；M-X1R高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司；平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi（布奇）公司；MX-S旋渦混勻儀，美國Scilogex公司；固相萃取裝置，美國SUPELCO公司；AUW120D超精密電子天平，日本島津公司；KQ5200超聲波清洗器，昆山超聲波儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 稱取一定量的五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容配置成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。使用時(shí)按照需要用流動相將上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品處理 地表水樣品：將采集回來的水樣1 L通過0.45μm水相濾膜過濾待用。準(zhǔn)確量取50 mL水樣，置于100 mL離心管中，用甲酸調(diào)節(jié)pH至2.0左右，渦旋混合30 s。將預(yù)處理的水樣在不抽真空的條件下全部轉(zhuǎn)移至已活化的HLB固相萃取柱中，待水樣全部過完后，加入5 mL純水進(jìn)行淋洗并吹干，加入4 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集全部洗脫液，于45℃下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1.0 mL甲醇-2 mmol/L乙酸銨溶液（2∶8，V∶V，含0.1%甲酸），漩渦混勻，過0.22μm微孔濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

漁業(yè)飼料樣品：稱取勻漿后的樣品5.00 g于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入氨化乙腈（pH 9～10）10 mL，混勻2 min，放入超聲機(jī)里超聲5 min，放入離心機(jī)以8000 r/min離心5 min，離心后將上清液轉(zhuǎn)移至25 mL離心管中，再次加入氨化乙腈提取一次，合并2次提取液并用氨化乙腈定容至25 mL。取5 mL提取液于45℃氮吹至干，加入2 mL 70%甲醇溶液，在漩渦混合儀上充分混合后，加入0.5 g C18吸附劑、0.5 g無水硫酸鎂及0.2 g中性氧化鋁，10000 r/min離心5 min，取上清液經(jīng)0.2 mm濾頭過濾，HPLC-MS/MS測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱為Capcell Pak C18（MGⅡ，50 mm×2.1 mm，1.9μm）；柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL，流動相A為甲醇；B為2 mmoL/L的乙酸銨溶液（含0.1%的甲酸）；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件 采用大氣壓電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式；噴霧電壓為3000 V；毛細(xì)管溫度為270℃；鞘氣流速為0.17 L/h；輔助氣流量為0.03 L/h；采用ESI+MRM多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行離子監(jiān)測，五氯酚的監(jiān)測離子對、碰撞能量、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 4種化合物的SRM采集參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 地表水前處理?xiàng)l件優(yōu)化 五氯苯酚在水樣中會進(jìn)行分子解離和帶電荷，水體中酸堿度大小的變化會改變五氯苯酚的離子化程度，進(jìn)而影響五氯苯酚在HLB固相萃取柱上的吸附效果。本文采用甲酸和氨水對預(yù)處理后的水樣進(jìn)行調(diào)節(jié)，比較了pH為1.0～6.0不同酸堿度的水樣，按照“1.3.2樣品前處理”進(jìn)行操作并上機(jī)測定該目標(biāo)物的回收率后發(fā)現(xiàn)當(dāng)水樣的pH為2.0左右時(shí)，五氯苯酚主要以分子形態(tài)存在，抑制其電離作用，從而增加萃取效率，提高目標(biāo)物的回收率。在固相萃取過程中，固相萃取填料的選擇、樣品酸堿度，上樣的速率、洗脫劑的選擇等都會影響固相萃取富集的效率，五氯苯酚結(jié)構(gòu)中有極性較強(qiáng)的羥基使其極性較強(qiáng)，pKa值為4.74。HLB柱是一種親水親脂的反相固相萃取柱，pH為7.5，對親水物質(zhì)和親脂物質(zhì)具有均衡的保留能力，適合非極性、弱極性和極性化合物。本文重點(diǎn)研究了常用的C18、HLB、中性氧化鋁等固相萃取柱，研究發(fā)現(xiàn)，HLB柱對目標(biāo)物的萃取效率要高于C18和中性氧化鋁柱，因此，本文選用HLB柱對水樣進(jìn)行富集和凈化。

2.2 漁業(yè)飼料前處理?xiàng)l件優(yōu)化 目前農(nóng)藥獸藥殘留常用的提取溶劑有乙腈、乙酸乙酯、甲醇、正己烷等有機(jī)溶劑，本文通過五氯苯酚的提取效率來比較這4種常用的有機(jī)溶劑。由五氯苯酚的回收率可知，乙酸乙酯對五氯苯酚提取的效率低，回收率為40%～50%；正己烷對五氯苯酚的提取效果較好，常用于對茶葉、飼料等物質(zhì)中農(nóng)藥的提取，但是由于飼料中含有豐富的脂肪，而正己烷對脂肪的溶解度大，會加大后期樣品凈化的難度；乙腈和甲醇對五氯苯酚的提取效率也較高，由于甲醇的提取液中含有少量雜質(zhì)，不利于凈化過程，容易造成色譜柱堵塞。五氯苯酚在堿性環(huán)境中溶解度更大，因此本文采用氨化乙腈來提取。

目前，對漁業(yè)飼料樣品的凈化多采用固相萃取凈化方式，根據(jù)五氯苯酚的結(jié)構(gòu)特征，本文研究了常用的HLB、C18、Oasis MAX 3種固相萃取小柱對五氯苯酚回收率的影響，結(jié)果表明，當(dāng)采用Oasis MAX固相萃取柱時(shí)，五氯苯酚的回收率最高，達(dá)到90%以上。這是由于HLB和C18小柱為反相固相萃取柱，目標(biāo)物的極性越大在柱中的保留能力越弱。Oasis MAX柱是一種混合型陰離子交換柱，化合物的pKa值決定了其在MAX柱中的保留能力，只有當(dāng)化合物的pKa值低于環(huán)境的pH時(shí)，化合物作為離子化狀態(tài)而被柱填料吸附保留。五氯苯酚存在羥基而極性較強(qiáng)，pKa值為4.74，而MAX柱的吸附環(huán)境pH為7.0～7.5，五氯苯酚的pKa值小于環(huán)境的pH而被吸附保留在柱中，采用酸化甲醇可將五氯苯酚完全的洗脫下來。

2.3 色譜條件的選擇及優(yōu)化 在液質(zhì)分析中，流動相多采用甲醇、乙腈和乙酸銨溶液，通過前處理凈化降低色譜的本底值后，采用合適的梯度洗脫程序，能使目標(biāo)物得到有效的分離和最佳的質(zhì)譜響應(yīng)信號。流動相的pH會影響目標(biāo)物在色譜柱中的分離，本文同時(shí)比較了乙腈-水（0.1%甲酸）、甲醇-水（0.1%甲酸）、乙腈-乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）、甲醇-乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）4種不同的流動相對目標(biāo)物的電離噴霧影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用甲醇-乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）作為流動相時(shí)，使目標(biāo)物色譜峰峰形尖銳、對稱性好，色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度高。五氯苯酚的SRM色譜圖見圖1。

圖1 五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 ng/mL）的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

2.4 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化 五氯苯酚苯環(huán)上連接著1個(gè)羥基[-OH]和5個(gè)氯原子，羥基[-OH]容易脫落1個(gè)H原子而形成[M-H]-離子峰，采用ESI負(fù)離子電離模式，將五氯苯酚標(biāo)液進(jìn)行一級全掃描，得到五氯苯酚的母離子。再將目標(biāo)物的母離子施以碰撞能量得到不同響應(yīng)強(qiáng)度的二級子離子，選擇豐度最大的作為定量離子，豐度次強(qiáng)的作為定性離子。五氯苯酚標(biāo)樣中子離子264.7的響應(yīng)值最大，因此選用264.7作為定量離子。在使用液質(zhì)法進(jìn)行檢測時(shí)，本方法選擇的子離子均符合歐盟657/2002/EC8規(guī)定的識別點(diǎn)要求。進(jìn)一步優(yōu)化電壓、碰撞能量、鞘氣與輔助氣流量等質(zhì)譜條件，使離子質(zhì)譜響應(yīng)信號達(dá)到最高。

2.5 方法的線性范圍和檢出限 將五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液用初始流動相稀釋成0.5～50μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用外標(biāo)法定量，以五氯苯酚的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，五氯苯酚定量離子的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得五氯苯酚的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見圖2。以3倍信噪比確定方法的LOD，10倍信噪比確定方法的LOQ，結(jié)合樣品的前處理過程，經(jīng)過樣品添加試驗(yàn)計(jì)算后得到方法的檢出限和定量限（表3）。

圖2 五氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 五氯苯酚的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 方法的回收率和精密度 取空白水樣和空白漁業(yè)飼料樣品，制得濃度為0.1、0.5、1.0μg/L和2.0、10、20μg/kg 3個(gè)添加水平的加標(biāo)樣品，本方法采用外標(biāo)法定量，按1.3.2節(jié)所述條件分別進(jìn)行添加回收率和精密度試驗(yàn)。每個(gè)添加水平重復(fù)測定5次，其平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表4。

2.7 實(shí)際樣品的測定 對長沙市周邊的養(yǎng)殖魚塘和湖泊等不同來源的地表水和長沙市農(nóng)貿(mào)市場、超市待售的漁業(yè)飼料進(jìn)行處理和測定。由結(jié)果可知，有3份養(yǎng)殖水樣中檢出五氯苯酚，其濃度值為0.64～1.22μg/L，說明仍有漁民在養(yǎng)殖過程中使用五氯苯酚作為殺蟲劑。

表4 五氯苯酚在空白樣品中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 小結(jié)

本文建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定漁業(yè)水體和漁業(yè)飼料中五氯苯酚殘留量的檢測方法。該方法線性關(guān)系良好，可在6 min內(nèi)完成對目標(biāo)物的分析，水樣和漁業(yè)飼料樣品的定量限分別為0.05μg/L和0.8μg/kg；該方法前處理簡單快速、試劑用量少，采用質(zhì)譜測定結(jié)果穩(wěn)定可靠、準(zhǔn)確度與精密度高。