SU5416在小鼠急性肺損傷中的作用及其機(jī)制研究

黃旭晴 蔣育悅 徐長青 郁東偉 王燕

急性肺損傷（ALI）常由實(shí)質(zhì)性肺部感染或肺部出血引發(fā)，是以肺泡毛細(xì)血管膜受損為特征的異質(zhì)性疾病，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難和頑固性低氧血癥[1]。全身性損傷如創(chuàng)傷、敗血癥和急性腎損傷等也會引發(fā)ALI[2-3]。ALI的主要病理特征為肺內(nèi)失控性炎癥反應(yīng)，如大量中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫?？刮⑸镏委熀椭С种委煹葘LI有一定的效果，但ALI病死率仍高達(dá)30%～40%[4]，因此，研發(fā)ALI其他有效的治療藥物意義重大。ALI早期，在肺部出現(xiàn)明顯纖維組織增生的同時存在肺部微血管增多[5]，大多數(shù)組織的損傷修復(fù)都伴隨著微血管的改變?；诖?，本研究旨在探討血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑Z-3-[（2,4-二甲基吡咯-5-烴基）亞甲基]-2-吲哚滿酮（SU5416）在小鼠ALI中的作用及其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 30只SPF級雄性C57BL/6小鼠（體重18～22g）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司。地塞米松購自百正藥業(yè)股份有限公司。SU5416購自美國Sigma公司。超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧簇（ROS）檢測試劑盒和 IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。人單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（bcl-2）、Toll樣受體 4（TLR4）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、VEGF 受體 2（VEGFR2）、NF-κB、磷酸化 NF-κB（pNF-κB）購自安諾論公司。β-actin抗體購自武漢博士德公司。電泳儀電源、垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品。正置光學(xué)顯微鏡為奧林巴斯公司產(chǎn)品。JEM-2100透射電子顯微鏡為日本電子公司產(chǎn)品。Abbott CD1700全自動動物血液細(xì)胞分析儀為邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠ALI模型制備與分組 將30只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、SU5416組、地塞米松組、SU5416+地塞米松組、空白對照組，各6只。小鼠以異氟醚麻醉。LPS用0.9%氯化鈉溶液溶解后，模型組、SU5416組、地塞米松組、SU5416+地塞米松組小鼠按5mg/kg的劑量滴鼻處理（均約0.5ml），空白對照組小鼠滴入等體積0.9%氯化鈉溶液。SU5416組小鼠在LPS處理1h后按20 mg/kg的劑量給予SU5416[以二甲基亞砜(DMSO）為溶媒]灌胃，地塞米松組小鼠按5mg/kg的劑量給予地塞米松（以DMSO為溶媒）灌胃，SU5416+地塞米松組小鼠按上述方法同時給予SU5416和地塞米松灌胃，空白對照組和模型組以等體積的含有DMSO的0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.2.2 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù) 各組小鼠灌胃干預(yù)24h后，使用40mg/kg劑量的戊巴比妥鈉麻醉；開胸，分離氣管，在氣管下穿一絲線，分離右主支氣管并用絲線結(jié)扎；于氣管環(huán)處剪一V型切口，插入直徑約2mm的無菌塑料管，絲線結(jié)扎固定，以4℃無菌0.9%氯化鈉注射液灌洗左肺（5ml×3次），反復(fù)抽吸3次，收集BALF于無菌瓶中。用Abbott CD1700全自動血細(xì)胞分析儀檢測各組小鼠BALF中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)目。

1.2.3 肺組織SOD、ROS活性檢測 取各小鼠部分肺組織，4℃勻漿器進(jìn)行勻漿，約12 000rpm，離心5min，提取上清液。參照SOD、ROS檢測試劑盒說明書方法進(jìn)行檢測，并按照公式分別計(jì)算出SOD與ROS活性。

1.2.4 肺組織炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平檢測 采用ELISA法，取各小鼠部分肺組織，4℃勻漿器進(jìn)行勻漿，約12 000rpm，離心5min，取上清液用于檢測 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平，操作參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 bcl-2、TLR4、VEGF、NF-κB 蛋白水平檢測 采用Western blot法。取部分肺組織勻漿液，加5×蛋白上樣緩沖液后煮沸5min。制備10%SDS-PAGE膠，按40μg蛋白量上樣；120V電泳1.5h；350mA轉(zhuǎn)膜50min；5%脫脂奶粉溶液封閉 2h，按比例加入 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGF2、NF-κB、pNF-κB 一抗后 4℃過夜；TBST 洗滌后加入二抗，作用2h；TBST洗膜后ECL顯像，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.2.6 肺組織病理形態(tài)觀察 取小鼠部分肺組織用10%甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡200倍視野下觀察肺組織病理形態(tài)。另取小鼠部分肺組織，切成1mm3左右的組織塊，戊二醛溶液固定，經(jīng)漂洗、固定、脫水、滲透、包埋、制片，用透射電子顯微鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察并比較5組小鼠（1）BALF中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)；（2）肺組織 SOD、ROS 活性；（3）肺組織炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平；（4）肺組織 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGFR2、NF-κB、pNF-κB 蛋白水平；（5）肺組織病理形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠BALF中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比較見表1。

表1 5組小鼠BALF中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（×104個）

由表1可見，5組小鼠BALF中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；兩兩比較，除SU5416組與地塞米松組外，其余組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。即模型組小鼠BALF中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞明顯增多，說明小鼠ALI模型制備成功。SU5416與地塞米松均能抑制LPS刺激導(dǎo)致的ALI，兩者之間沒有明顯差異，但兩者聯(lián)用的抑制作用明顯強(qiáng)于其中一種單獨(dú)使用。

2.2 5組小鼠肺組織SOD、ROS活性比較 見表2。

表2 5組小鼠肺組織SOD、ROS活性比較

由表2可見，5組小鼠肺組織SOD、ROS活性比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；兩兩比較，除SU5416組與地塞米松組小鼠肺組織SOD活性外，其余組間肺組織SOD、ROS活性比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。即模型組小鼠肺組織SOD活性明顯下降，ROS活性明顯上升；SU5416與地塞米松都能明顯逆轉(zhuǎn)這種改變，對SOD活性的改變，兩者沒有明顯差異，而地塞米松對ROS活性的改變更明顯，兩者聯(lián)用的逆轉(zhuǎn)改變明顯強(qiáng)于其中一種單獨(dú)使用。

2.3 5 組小鼠肺組織炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1水平比較 見表3。

表3 5組小鼠肺組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1水平比較（pg/mgprot）

由表3可見，5組小鼠肺組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；兩兩比較，除SU5416組與地塞米松組外，其余組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。模型組小鼠肺組織炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平均明顯上升，SU5416和地塞米松都能明顯逆轉(zhuǎn)這種改變，兩者之間沒有明顯差異，但兩者聯(lián)用的逆轉(zhuǎn)改變明顯強(qiáng)于其中一種單獨(dú)使用。

2.4 5 組小鼠肺組織 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGFR2、NF-κB、pNF-κB蛋白水平比較 見圖1、表4。

由圖1、表4可見，5組小鼠肺組織bcl-2、TLR4、VEGF、NF-κB蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。即模型組小鼠肺組織在LPS刺激下抗凋亡蛋白 bcl-2 的表達(dá)下調(diào)，TLR4、VEGR、VEGFR2 和 pNF-κB的表達(dá)上調(diào)；SU5416與地塞米松均能明顯逆轉(zhuǎn)這些改變；與模型組比較，地塞米松組小鼠肺組織TLR4、VEGF的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而VEGFR2、pNF-κB表達(dá)明顯下調(diào)，抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)明顯上調(diào)。SU5416與地塞米松兩者聯(lián)用的逆轉(zhuǎn)改變明顯強(qiáng)于其中一種單獨(dú)使用。

圖 1 5 組小鼠肺組織 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGFR2、NF-κB、pNF-κB蛋白電泳圖

2.5 5組小鼠肺組織病理形態(tài)比較 見圖2。

由圖2可見，光學(xué)顯微鏡下可見空白對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，無充血，肺泡間隔正常，個別區(qū)域可見少量炎癥細(xì)胞浸潤；模型組小鼠可見明顯的肺泡炎癥表現(xiàn)，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)可見水腫液，肺泡毛細(xì)血管充血、肺泡間隔厚度增加，并出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組相比，SU5416組、地塞米松組小鼠肺泡間隔減小，炎癥細(xì)胞浸潤減輕，肺泡結(jié)構(gòu)破壞減輕。SU5416+地塞米松組上述情況進(jìn)一步減輕，接近正常。

電子顯微鏡下可見空白對照組小鼠肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)和肺泡毛細(xì)血管膜結(jié)構(gòu)基本正常。模型組小鼠肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞器減少，肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮剝脫，肺泡壁嚴(yán)重破壞、壞死，肺泡間的間隔增寬，出現(xiàn)彌漫性的水腫，肺泡腔萎陷。與模型組相比，SU5416組、地塞米松組小鼠肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞器增多，肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮少見剝脫，肺泡間的間隔縮小，水腫的肺泡萎陷程度減輕。SU5416+地塞米松組肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)和肺泡毛細(xì)血管膜結(jié)構(gòu)接近正常。

表 4 5 組小鼠肺組織 bcl-2、TLR4、VEGF、VEGFR2、NF-κB、pNF-κB 蛋白水平比較

圖2 5組小鼠肺組織病理形態(tài)比較（a：光學(xué)顯微鏡下所見，HE染色，×200；b：電子顯微鏡下所見，×10 000）

3 討論

本研究結(jié)果提示，LPS所致小鼠BALF中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)目的改變，肺組織SOD、ROS活性，炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平，以及病理形態(tài)的改變說明小鼠ALI模型制備成功。地塞米松干預(yù)ALI在炎癥細(xì)胞沉積、炎癥介質(zhì)釋放及肺水腫等方面均可發(fā)揮積極的作用。研究發(fā)現(xiàn)，低劑量地塞米松較高劑量更能改善肺炎癥介質(zhì)的釋放[6]。因此本研究采用低劑量地塞米松干預(yù)作為陽性對照。

氧化應(yīng)激由機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡導(dǎo)致，這兩大系統(tǒng)于機(jī)體內(nèi)既相互制約又相互依存。ROS屬于氧化系統(tǒng)，而SOD屬于抗氧化系統(tǒng)。近年來，在ALI的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在ALI的病理發(fā)展過程中扮演重要角色[7]?？寡趸瘎┲委熞呀?jīng)成為一些肺臟疾病的一種新方向，如N-乙酰半胱氨酸在臨床上表現(xiàn)出對ALI一定的治療效果[8-9]。本研究結(jié)果顯示，SU5416與地塞米松均能夠明顯抑制ROS活性，提高SOD的活性，減輕氧化應(yīng)激，兩者聯(lián)合干預(yù)比單獨(dú)干預(yù)效果更好。

ALI是全身性炎癥之于肺部的具體表現(xiàn)，它的病理生理特點(diǎn)主要為中性粒細(xì)胞大量聚集導(dǎo)致炎癥持續(xù)存在[10]。ALI時肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞激活，同時釋放多種炎癥因子如 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1等，引起肺以及免疫系統(tǒng)的功能失調(diào)。中性粒細(xì)胞在炎癥的初始階段即參與其發(fā)生、發(fā)展，中性粒細(xì)胞的過度活化或持續(xù)存在會大量破壞基底膜，最終增強(qiáng)肺泡毛細(xì)血管通透性[11]。淋巴細(xì)胞在ALI的炎癥反應(yīng)過程中也起著重要的調(diào)控作用[12]。TLR4是LPS受體，其作用是識別侵入體內(nèi)的革蘭陰性細(xì)菌并啟動炎癥反應(yīng)。TLR4激活將引起一系列下游分子的活化，并活化通用轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB、AP-I等最終引起以 TNF-α、IL-1 等為中心的促炎癥因子激活，放大炎癥效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，SU5416與地塞米松均能夠減輕肺組織的炎癥反應(yīng)，抑制 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 的表達(dá)，兩者聯(lián)用具有更好的效果。

血管活性物質(zhì)和血管相關(guān)生長因子在ALI的發(fā)展中亦起重要作用[12-13]。VEGF是目前已知最強(qiáng)的血管滲透劑，在肺組織高表達(dá)，除此之外在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、活化的肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中也都有表達(dá)。在病理情況下，肺泡上皮屏障被破壞，血管內(nèi)皮細(xì)胞直接暴露于高濃度的VEGF，血管通透性增加，導(dǎo)致非心源性肺水腫[14]。VEGF作用機(jī)制就是與VEGFR結(jié)合，增加一氧化氮的釋放，刺激前列環(huán)素的產(chǎn)生，增加血管通透性[15]。且炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等均能誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，TLR4-NF-κB信號傳導(dǎo)通路也能夠介導(dǎo)VEGF的表達(dá)[16]。本研究結(jié)果顯示，SU5416能夠有效抑制VEGF和VEGFR的表達(dá)，此外SU5416能抑制TLR4表達(dá)，提高pNF-κB的表達(dá)。而地塞米松對于VEGF、TLR4沒有調(diào)控作用，說明地塞米松不是通過調(diào)控VEGF、TLR4途徑來發(fā)揮作用的。

細(xì)胞凋亡在ALI/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）發(fā)病中起至關(guān)重要的作用。在ALI/ARDS的發(fā)病中存在兩個重要的細(xì)胞凋亡相關(guān)機(jī)制。ROS又是細(xì)胞凋亡的重要媒介之一，可作為第二信使觸發(fā)凋亡信號途徑，如增加線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）通透性，釋放CytC入細(xì)胞質(zhì)，促凋亡因子釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此不難想到，凋亡在ALI中會發(fā)揮重要作用[17]。本研究檢測了抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)水平。SU5416和地塞米松均能上調(diào)bcl-2的表達(dá)，抑制凋亡。

綜上所述，SU5416對小鼠ALI具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過減輕炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及調(diào)控TLR4/VEGF/NF-κB信號通路實(shí)現(xiàn)。