蓮藕資源耐鹽性評價

周志疆，張 楨，蔣潤枝，惠林沖，程立寶*

（1.江蘇豐收大地種業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇 鹽城 224000；2.揚州大學，江蘇 揚州 225000）

蓮藕是多年生宿根水生草本植物，因其豐富的營養(yǎng)成分和較高的保健作用，成為深受人們喜愛的水生蔬菜之一[1]。近幾年，由于對蓮藕加工產(chǎn)品的不斷開發(fā)利用，蓮藕已成為我國重要的出口創(chuàng)匯蔬菜之一[2]。荷花花色艷麗、香味高雅，是中國園林中重要的水景布置植物材料。蓮因其藥食兼用和觀賞價值，深受廣大人民喜愛[3]。

植物在受鹽脅迫時，通過一系列的細胞滲透壓和離子平衡途經(jīng)降低或抵消鹽分的傷害，以維持正常生長發(fā)育的行為稱作植物的耐鹽性[4]。目前，有關(guān)植物耐鹽性鑒定和品種篩選的研究有很多。植物的耐鹽性是植物體內(nèi)一系列因素綜合作用的結(jié)果，鹽脅迫下，植物根系總吸收面積受到抑制，隨著鹽脅迫時間的不斷增加，根系吸收能力持續(xù)下降，導致光合速率下降，植物葉綠素含量不斷降低。正常生長狀態(tài)下，植物活性氧的形成和消除處于動態(tài)平衡，植物遭受鹽脅迫后，導致自由基積累，引起植物氧化損傷，但是超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等作為植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，能夠有效加強活性氧清除能力，緩解鹽對植物的傷害。根系活力、酶活性、葉綠素含量、質(zhì)膜相對透性等生理指標均可以衡量植物受到鹽脅迫后的傷害，這些單一生理指標存在差異性；所以，很難用單一的某個生理指標來評價植物的耐鹽性。

近年來，不斷惡化的土壤環(huán)境制約著農(nóng)作物的生長發(fā)育，土壤鹽漬化是土壤生產(chǎn)力發(fā)生劣變的常見現(xiàn)象，我國土壤鹽漬化已經(jīng)嚴重制約了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。調(diào)查表明，在鹽漬化較高的地區(qū)，通過栽培蓮藕，既能取得一定的經(jīng)濟效益，又能達到以水洗鹽、以水壓鹽的目的，同時改良土壤環(huán)境。到目前為止，國內(nèi)外關(guān)于蓮藕耐鹽性狀的研究較少，本試驗通過綜合評價篩選蓮藕耐鹽資源，以期為設施鹽漬化土壤和沿海灘涂地區(qū)選育適合栽培的耐鹽蓮藕新品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以揚州大學園藝與植物保護學院水生蔬菜實驗室保存的E1、E2、E3、E4、H2、H5、H8蓮藕資源為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 試驗方案

2017年5月，于揚州大學水生蔬菜試驗基地防雨棚內(nèi)準備長×寬×高分別為60 cm×40 cm×30 cm且鋪2層0.08 mm厚的塑料薄膜的泡沫箱，每個泡沫箱中裝土0.048 m3，種植4株種藕后裝滿水，每個蓮藕資源種植9箱。種藕大小基本一致，且?guī)ы斞?。待蓮藕匍匐莖長出7、8條時，倒出泡沫箱中的水，替換成濃度為0.6%NaCl溶液（通過多年的研究發(fā)現(xiàn)，NaCl濃度過低，處理后蓮藕植株的表型變化不明顯，濃度過高，植株全部死亡，0.6%NaCl溶液恰好能夠區(qū)分蓮藕的耐鹽能力），體積為20 L，此后每天觀察記錄長勢，第5天進行鹽害指數(shù)調(diào)查，對照為等體積清水處理。為了進一步驗證蓮藕資源的耐鹽特性，同樣利用上述0.6%NaCl處理蓮藕資源，在第5天對每個蓮藕資源的葉和根進行隨機取樣，測定蓮藕資源的質(zhì)膜相對透性、丙二醛、SOD和POD活性、根系活力及葉綠素含量（重復3次），通過計算隸屬函數(shù)值，區(qū)分蓮藕不同資源的耐鹽性。

1.2.2 測定指標及方法

1.2.2.1 不同蓮藕資源鹽害指數(shù)調(diào)查

利用0.6%NaCl處理蓮藕資源，之后5d內(nèi)，每天觀察并統(tǒng)計蓮藕葉片形狀、顏色和受害癥狀。按照表1進行分級，然后根據(jù)如下公式計算鹽害指數(shù)：

1.2.2.2 生理指標的測定

葉綠素含量的測定參照李合生等[6]的方法。稱0.2 g研磨成粉的蓮藕葉片，加入裝有25 mL 95%乙醇的50 mL試管中，混勻后將試管放置于黑暗中2 h。652 nm波長下測定上清液的吸光值。試驗均采取3次重復。公式如下：

式中V為提取液總量，W為葉片鮮質(zhì)量。

丙二醛含量的測定參照李合生等[6]的方法。稱取0.2 g在液氮狀態(tài)下研磨成粉的蓮藕葉片，加入2 mL 5%的三氯乙酸溶液后于震蕩器上充分混勻，12 000 r/min離心20 min，提取上清液。吸取1.0 mL離心的上清液，加入1.0 mL 0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，混勻于沸水浴上反應10 min，迅速冷卻后取上清液4 000 r/min離心10 min。于450 、532、600 nm波長下測定上清液吸光值。試驗均采取3次重復。公式如下：

式中，VT為提取液體積，V1為測定用提取液體積，G為材料鮮質(zhì)量。

SOD活性的測定參照張志良等[7]的方法。稱取0.3 g在液氮狀態(tài)下研磨成粉的蓮藕葉片，加入2 mL磷酸緩沖液，緩沖液的pH值為7.8。12 000 r/min 4 ℃離心20 min，提取上清液，并于低溫保存?zhèn)溆谩Ｔ?0 mL離心管中加入2 mL磷酸緩沖液、104 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液0.5 mL、300 umol/L氮藍四唑（NBT）溶液 1 mL、0.8 mol/L EDTA-2Na溶液0.5 mL、320 umol/L核黃素50 uL、上清液50 uL；對照管加磷酸緩沖液?；靹蚝髮⒁恢φ展苤冒堤幾骺瞻讓φ?，利用4 000 lx的熒光燈照射其余各管30 min，待各管溶液顏色變黑褐后，用黑紙遮光終止反應。以不照光的對照管為空白對照，在560 nm波長下比色測OD值，試驗均采取3次重復。公式如下：

式中，ACK為光照下對照管的吸光值；AE為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積；VT為測定時樣品用量；W為樣品鮮質(zhì)量。

POD活性的測定按表2加入各種試劑。在樣品管中加10 uL 0.04 mol/L過氧化氫溶液，立刻搖勻，在470 nm處測OD值，讀出第2分鐘、第3分鐘的OD值。公式如下：

式中，A470為反應期間某時刻的吸光度值；△A470為反應時間內(nèi)吸光度值的變化；W為樣品鮮質(zhì)量；t為反應時間；VT為提取酶液總體積；Vs為酶液用量。

表1 蓮藕鹽處理后葉片受害分級

表2 各試管中需要加入試劑的量mL

根系活力測定參照張志良等[7]的方法。在稱量皿中加入0.8 g蓮藕根樣品，加入10 mL 0.4%氯代三苯基四氮唑（TTC）溶液和磷酸緩沖液的等量混合液，讓根充分浸沒在溶液內(nèi)，于37 ℃下暗保溫2 h后再加入2 mL濃度為1 mol/L的硫酸，以停止反應。對照處理先加硫酸，后加樣品，其他操作同上。在20 mL試管中加入吸干水分的根，并加10 mL甲醇，密封放于避光處靜置2 h，待根變?yōu)榘咨珪r，在波長485 nm分光光度計下比色，以空白對照作參數(shù)測出吸光度，四氮唑還原量表示根系活力強弱，試驗均采取3次重復。公式如下：

質(zhì)膜相對透性參照張志良等[7]的方法。用無離子水洗凈0.2 g鮮樣葉片，剪碎放入已加入20 mL無離子水的50 mL試管，振蕩30 min后于室溫下靜置30 min，用DDBJ-350型電導率儀測定溶液的電導率E1。然后將試管放置于沸水浴中10 min，冷卻后測定溶液總電導率E2，以無離子水電導率E0為參照，按以下公式計算質(zhì)膜相對透性（P），試驗均采取3次重復。公式如下：

1.2.3 耐鹽性綜合評價

通過隸屬函數(shù)分析法，在上述0.6%NaCl處理蓮藕資源5 d內(nèi)的生理指標（鹽害指數(shù)、葉綠素含量、丙二醛含量、SOD活性、POD活性、根系活力及質(zhì)膜相對透性）測定的基礎(chǔ)上，全面評價了7種蓮藕資源的耐鹽特性。公式如下：

式中，X(μ1)和X（μ2）分別為正負相關(guān)指標的隸屬函數(shù)值；X為上述指標測定值，Xmin為測定指標的最小值，Xmax為測定指標的最大值。

通過加權(quán)葉綠素含量、丙二醛含量、SOD活性、POD活性、根系活力及質(zhì)膜相對透性指標的隸屬函數(shù)值，最后計算出平均值，具體詳見彭振等[8]方法。鹽害指數(shù)隸屬函數(shù)值為X（μ11），質(zhì)膜相對透性隸屬函數(shù)值為X（μ12），葉綠素含量隸屬函數(shù)值為X（μ13），根系活力隸屬函數(shù)值為X（μ14），過氧化物酶隸屬函數(shù)為X（μ15），超氧化物歧化酶隸屬函數(shù)為X（μ16），丙二醛隸屬函數(shù)值為X（μ21）。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件中One-Way ANOVA分析Duncan法（P＜0.05）進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蓮藕資源在NaCl處理下形態(tài)和生理指標的變化

2.1.1 不同蓮藕資源在NaCl處理下的鹽害指數(shù)

據(jù)觀察，0.6%NaCl溶液處理2 d內(nèi)，蓮藕材料外觀形態(tài)上沒有發(fā)生明顯鹽害現(xiàn)象。由圖1可知，處理5 d后，植株葉片開始萎蔫，表現(xiàn)出不同程度的鹽害，其中H5、H8長勢較好，受到鹽害影響較輕，新葉能夠正常展開；H2和E3受傷害程度最大，大部分葉片失水干枯、皺縮卷曲，新葉不能正常開展，畸形扭曲，葉片發(fā)黃，并生有黑斑。由圖2可知，蓮藕材料在0.6%NaCl溶液處理第5天，H2受到鹽害影響程度最大，與其他蓮藕材料的鹽害指數(shù)有顯著差異；E1、E2、E3、E4受到鹽害影響程度處于中間值，而H5和H8受鹽害影響程度比較低，其中H5蓮藕材料鹽害指數(shù)最低，說明鹽脅迫下，H5耐鹽能力最強，而H2耐鹽能力最差。

2.1.2 不同蓮藕資源在NaCl處理下的葉綠素含量

圖3表明，各種蓮藕材料在0.6%NaCl溶液處理后葉綠素含量存在差異，其中，E1含量最低，與其他材料葉綠素含量差異顯著，表明耐鹽性最低。H2和E3葉綠素含量相同，均為0.16%，差異不顯著，且H2、E3和E1葉綠素含量均較低，表明H2、E3和E1受鹽脅迫后導致光合作用下降，葉綠素含量減少嚴重。E2、E4、H5和H8葉綠素含量較高，表明耐鹽性相對較強。

2.1.3 不同蓮藕資源在NaCl處理下的質(zhì)膜相對透性

由圖4可知，0.6%NaCl溶液處理后H2質(zhì)膜相對透性最高，高達45.01%，但與質(zhì)膜相對透性為40.89%的E3差異不顯著，顯著高于其他蓮藕資源，說明鹽脅迫對H2和E3葉片傷害程度較大，H2和E3耐鹽性較差；H8質(zhì)膜相對透性最低，且與E1、H5差異不顯著，說明這3種蓮藕受到鹽脅迫傷害相對較小，耐鹽能力較高。

2.1.4 不同蓮藕資源在NaCl處理下的根系活力

根系活力作為衡量根系抵御逆境能力的重要生理指標，能夠反映出植株耐鹽能力。由圖5可知，蓮藕材料受0.6%NaCl處理后H5的根系活力最高，為128.80 mg/（g·h），且與其他材料根系活力之間差異顯著；E3根系活力最低，為34.76 mg/（g·h），但與蓮藕材料E1、E2、E4、H2之間差異不顯著；H8根系活力僅次于H5，但與H2之間差異不顯著。

圖1 NaCl處理對蓮藕生長的影響

圖2 不同蓮藕資源在NaCl處理下的鹽害指數(shù)

圖3 不同蓮藕資源在NaCl處理下的葉綠素含量

圖4 不同蓮藕資源在NaCl處理下的質(zhì)膜相對透性

2.1.5 不同蓮藕資源在NaCl處理下的丙二醛含量

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷；因此，在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個常用指標，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。圖6表明，蓮藕資源受鹽脅迫后，E4的MDA含量最高，并且顯著高于其他蓮藕資源，說明E4受到的損傷最高，耐鹽性最差；H5的MDA含量最低，但與其他蓮藕材料MDA含量之間差異不顯著。

2.1.6 不同蓮藕資源在NaCl處理下的POD和SOD含量

圖5 不同蓮藕資源在NaCl處理下的根系活力

圖6 不同蓮藕資源在NaCl處理下的丙二醛含量

SOD、POD是重要的保護酶，可以有效地清除膜脂過氧化物對細胞造成的傷害。由圖7可知，0.6%NaCl處理5 d后，E1、E3的POD活性較低，僅為60.93 、29.39 U/（g·min），二者之間差異不顯著；H5的POD活性最高，為1 151.62 U/（g·min），但與POD活性為795.70 U/（g·min）的H8之間差異不顯著。H5和H8與其他蓮藕資源POD活性存在顯著差異。由圖8可知，E1的SOD活性最高，E1、H5、E2和H2的SOD活性差異不顯著，但高于其他蓮藕材料；蓮藕材料E4的SOD活性最低。

2.2 蓮藕資源耐鹽性綜合評價

采用隸屬函數(shù)法對蓮藕資源耐鹽性進行分析，得到的單一指標的隸屬函數(shù)值與最終的平均隸屬函數(shù)值排序并不完全一致，說明單一指標不能準確反映出蓮藕耐鹽能力（表3）。7份蓮藕資源耐鹽能力差異明顯，順序依次是：H5＞H8＞E2＞E4（E1）＞E3＞H2。H5、H8品種耐鹽能力相對較強，E1、E2、E4品種耐鹽性相對中等，E3和H2品種耐鹽性相對較弱。

3 結(jié)論與討論

植物耐鹽資源一般通過種子萌發(fā)期、苗期表現(xiàn)及產(chǎn)量進行篩選，需要綜合評價植物全生育期生理數(shù)據(jù)和終產(chǎn)量才更可靠[9]。由于蓮藕繁殖多為無性繁殖，且蓮藕種子多為雜合，所以利用種子萌發(fā)期和最終產(chǎn)量評價試驗蓮藕資源難以實施，因此本試驗在蓮藕苗期進行了資源篩選。

圖7 不同蓮藕資源在NaCl處理下的POD活性

圖8 不同蓮藕資源在NaCl處理下的SOD活性

表3 蓮藕資源耐鹽性隸屬函數(shù)與綜合評判結(jié)果

熊雪等[10-11]研究不同紫花苜蓿品種在鹽脅迫下的耐鹽性，以電導率、丙二醛、葉綠素、脯氨酸含量、根系活力等作為耐鹽性鑒定指標，再通過隸屬函數(shù)法對6個紫花苜蓿品種在不同濃度鹽脅迫下的耐鹽性進行綜合評價。本試驗對蓮藕材料的鹽害指數(shù)、丙二醛、根系活力、葉綠素、細胞質(zhì)膜相對透性和抗氧化酶等指標綜合分析后，發(fā)現(xiàn)鹽害指數(shù)大小與耐鹽性綜合評價基本一致，該指標可以作為蓮藕耐鹽性分析的重要單項指標之一。茄子在不同濃度鹽脅迫下，隨著脅迫濃度的增加，光合速率呈現(xiàn)下降趨勢，葉綠體結(jié)構(gòu)損傷引起非氣孔限制[12]。用5種不同濃度NaCl處理辣椒發(fā)現(xiàn)與對照相比，隨著NaCl濃度的增加，辣椒質(zhì)膜系統(tǒng)受損，細胞質(zhì)膜透性不斷增加，電解質(zhì)外滲，電導率升高[13]。本試驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蓮藕材料受到鹽脅迫后，H2和E1葉綠素含量最低，葉片受到的鹽害最嚴重，生長發(fā)育受到抑制，這與前人研究結(jié)果基本一致；因此葉綠素和質(zhì)膜相對透性可以作為鑒定植物耐鹽性的指標。MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，是評價生物膜受損程度的一個重要指標。壇紫菜葉狀體受不同濃度鹽脅迫后，低濃度鹽脅迫下壇紫菜葉狀體的氧化損傷要顯著高于高濃度鹽脅迫，說明其含量與植物耐鹽性呈負相關(guān)[14]。本試驗中，蓮藕受鹽脅迫后，E4中MDA含量最高，與其他6個蓮藕材料的MDA含量差異顯著，而其他6個蓮藕材料MDA含量差異不顯著。邢建宏等[15]利用低中高3種不同的鹽濃度處理秋茄根系，分析其根系活力，發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的增加，秋茄根系活力呈現(xiàn)下降趨勢，對秋茄的生長發(fā)育起到抑制作用。蓮藕材料中H5根系活力最高，與其他根系活力有顯著性差異，說明根系活力強弱可以體現(xiàn)植物的耐鹽性強弱。

植物的生理生化和形態(tài)指標在受到鹽脅迫后會發(fā)生一系列變化，通常單一指標難以準確反映植物耐鹽性，但利用隸屬函數(shù)法可以準確評價菊芋[16]、甜高粱[17]、茄子[18]和水稻[19]等植物的耐鹽性。利用0.6%NaCl溶液處理后，蓮藕資源的鹽害指數(shù)、葉綠素、丙二醛、抗氧化酶活性及根系活力指標差異較大，其中E1葉綠素含量最低，說明E1受到的鹽害最大，耐鹽性最差；E4的MDA含量最高，并且顯著高于其他蓮藕資源，說明E4受到的損傷最高，耐鹽性最差；E2受到鹽脅迫后葉綠素含量最高，但MDA含量不是最高，表明單一指標難以準確評價蓮藕材料的耐鹽性。