新的血小板活化診斷標(biāo)志物sGPⅥ及其臨床意義*

周雅君，曹陶

深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院、深圳市第二人民醫(yī)院 1藥學(xué)部，2腎內(nèi)科(廣東深圳 518000)

血小板在對(duì)血管損傷部位的原發(fā)性止血和血栓形成過程中發(fā)揮著重要的作用，監(jiān)測(cè)血小板的異常活化對(duì)了解機(jī)體血栓的生成和病情的進(jìn)展具有重要意義。血小板膜受體在不同的病理生理?xiàng)l件下可被不同的激動(dòng)劑活化，從而形成血栓或參與炎癥的發(fā)生[1]。血小板膜蛋白受體在藥物、蛋白水解、剪切力或氧化還原作用下可活化，亦可脫落，從而導(dǎo)致跨膜血小板受體的不可逆清除。近年來，血小板糖蛋白(gluco protein，GP)Ⅵ的病理生理性脫落得到了廣泛的關(guān)注和研究。在心血管疾病患者中，GPⅥ的脫落對(duì)血小板的黏附、活化及隨后血管損傷或炎癥部位血栓的形成具有重要的意義[1-2]。因此，本綜述總結(jié)了GPⅥ脫落后在不同的血栓性疾病中的意義，期待在血栓性事件(如心肌梗死等)高?；颊?，缺血性中風(fēng)和動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的治療和診斷中，將GPⅥ作為一個(gè)具代表意義的診療相關(guān)靶點(diǎn)。

1 血小板表面GPⅥ

大多數(shù)GPⅥ分子以單體形式存在于靜息的人血小板中，可溶性受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)的受體的二聚化，從而使血小板被膠原蛋白活化[3]。配體誘導(dǎo)的GPⅥ交聯(lián)通過Src激酶Fyn和Lyn觸發(fā)在其ITAMs的FcRγ鏈酪氨酸磷酸化。這導(dǎo)致隨后的招募和隨后的串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域包含酪氨酸激酶Syk的活化，而這依次又啟動(dòng)一個(gè)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包含活化T細(xì)胞(LAT)的銜接蛋白和SH2結(jié)構(gòu)域含有76 kD的白細(xì)胞蛋白(SLP-76)，并最終激活眾多的效應(yīng)分子，包括磷脂酶PLCγ2(PLCγ2)和磷酸肌醇3激酶(PI3K)。通過GPⅥ基本的信號(hào)通路被認(rèn)為是通過其鄰近的免疫酪氨酸抑制基序(ITIM)包含的受體有如PECAM-1、CEACAM1或GVIb，這已被證明是作為GPⅥ/ FcRγ-鏈可介導(dǎo)的血小板負(fù)調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

GPⅥ通過膠原對(duì)血小板的活化是必不可少的，但同其他配體如層粘連蛋白亦可相互作用。當(dāng)人類和小鼠血小板GPⅥ缺乏或功能受阻時(shí)，對(duì)膠原蛋白的激動(dòng)無反應(yīng)，導(dǎo)致部分黏附反應(yīng)減弱、取消Ca2+的流出、顆粒的釋放、聚集和促凝血反應(yīng)，而其他激動(dòng)劑活化血小板的反應(yīng)強(qiáng)度不變，顯示GPⅥ在血小板膜蛋白中的特殊性，及對(duì)富含膠原蛋白的損傷部位的血栓形成具有的基礎(chǔ)性作用。

2 GPⅥ對(duì)血栓的必要性和對(duì)止血的非必要性

臨床報(bào)道及實(shí)驗(yàn)研究均顯示GPⅥ的缺失對(duì)正常止血功能來說影響不大[4-5]。只有少數(shù)患者GPⅥ缺陷，主要是由于自身抗體誘導(dǎo)受體損失。這些患者表現(xiàn)出輕微的出血紊亂疾病，膠原不能誘導(dǎo)其血小板產(chǎn)生聚集[6]。在基因敲除GPⅥ基因的小鼠[7]、FcRγ-鏈缺失無法表達(dá)GPⅥ的小鼠[8]和給予抗GPⅥ抗體的野生型小鼠均只顯示出尾出血時(shí)間輕微延長(zhǎng)。Grüner等[9]研究發(fā)現(xiàn)，缺失GPⅥ功能的小鼠可通過敏感性的G蛋白介導(dǎo)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)使整合素α2β1活化，其能部分地補(bǔ)償GPⅥ功能的缺失。

與此形成鮮明對(duì)比，GPⅥ在止血過程中的作用相對(duì)較小，在體內(nèi)介導(dǎo)血小板堅(jiān)固的附著在受傷的動(dòng)脈壁和隨后的血栓形成過程中，此受體似乎發(fā)揮了主導(dǎo)作用。這首先在小鼠得到證實(shí)[10]，表現(xiàn)在封閉抗GPⅥ抗體的F(ab)片段和隨后小鼠抗體誘導(dǎo)或遺傳(GP6-/-，F(xiàn)cer1g-/-)GPⅥ缺失模型中。GPⅥ的缺乏癥抑制了ApoE基因缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊損傷后血栓的形成。臨床研究顯示，短暫性腦缺血和中風(fēng)的患者血小板表面GPⅥ表達(dá)增加[11]，急性缺血性卒中患者檢測(cè)到胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性GPⅥ(sGPⅥ)的水平升高，顯示出GPⅥ在此部位的活化。

3 誘導(dǎo)血小板GPⅥ脫落的途徑/因素

在一些研究血小板受體脫落的臨床研究和動(dòng)物模型中，均提供了發(fā)生GPⅥ體內(nèi)脫落的證據(jù)[12-13]。膠原、CRP和蛇毒Convulxin,這些血小板GPⅥ的配體活化血小板后，導(dǎo)致一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而通過蛋白水解的途徑使GPⅥ胞外域脫落[14]，釋放可溶性55 kD片段(sGPⅥ)，而其10 kD片段則仍殘留在血小板膜上。GPⅥ的脫落亦可由脫落酶引起，其為一類內(nèi)源性膜相關(guān)的蛋白酶。誘導(dǎo)GPⅥ脫落的主要脫落酶是金屬蛋白酶(ADAM)家族的成員，ADAM10，其可對(duì)胞膜臨近的GPⅥ胞外域部分進(jìn)行剪切而導(dǎo)致脫落[15]。GPⅥ的脫落還可由N-乙基馬來酰亞胺(NEM)、W7、PMA和線粒體解耦劑羰基氰化物3-氯苯肼(CCCP)、及血小板GPⅥ特異性受體激動(dòng)劑或抗GPⅥ及抗血小板抗體[12，16-21]所誘導(dǎo)；但vWF誘導(dǎo)活化的GPIbα不能引起顯著的GPⅥ的脫落，提示GPⅥ和GPIbα導(dǎo)致GPⅥ脫落的潛在機(jī)制不同。不論是否存在αⅡbβ3、GPIbα的表達(dá)活化或抑制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，病理生理的剪切速率(3 000～10 000 s-1)均可誘導(dǎo)金屬蛋白酶依賴GPⅥ胞外脫落[13，22]。GPⅥ胞外域脫落不僅可被誘導(dǎo)，亦可被抑制。GPⅥ剪切部位突變可導(dǎo)致脫落的被抑制[17]。EDTA、廣譜金屬蛋白酶抑制劑GM6001、和腫瘤壞死因子(TNF)-α蛋白酶抑制劑(TAPI)均可抑制金屬蛋白酶依賴GPⅥ的脫落。

4 評(píng)估血小板GPⅥ脫落的方法及臨床意義

目前，評(píng)估血小板GPⅥ的脫落可采用流式細(xì)胞術(shù)、蛋白印跡(Western blot)法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞術(shù)是應(yīng)用相關(guān)的抗體檢測(cè)GPⅥ胞外域的表達(dá)。Western blot可檢測(cè)GPⅥ水解的程度和相關(guān)分子量蛋白水解片段的表達(dá)量。檢測(cè)血漿中GPⅥ脫落的受體，眾多實(shí)驗(yàn)室采用的是酶聯(lián)免疫吸附法[12，19]，此方法較簡(jiǎn)便、快捷。利用光學(xué)或電阻抗進(jìn)行的聚集檢測(cè)GPⅥ激動(dòng)劑(膠原、CRP)同樣能檢測(cè)GPⅥ的脫落，但這些方法并不能表達(dá)受體間精細(xì)的變化，且對(duì)血小板減少癥的患者無應(yīng)用意義。健康的人血漿含有可檢測(cè)水平血小板源性可溶性受體的碎片如：GPIbα、GPV、sGPⅥ[23]。降低血小板表面的表達(dá)pGPⅥ可導(dǎo)致受體的脫落從而導(dǎo)致血小板活化，這同選擇性的膠原誘導(dǎo)的GPⅥ依賴的聚集是相對(duì)應(yīng)的。然而，膜相關(guān)的剩余GPⅥ的片段在健康人身上是檢測(cè)不到的[17，24]。在另一方面，血漿sGPⅥ水平的升高也可能起作用作為血小板活化和GPⅥ脫落的潛在生物標(biāo)志物。

sGPⅥ被認(rèn)為是一種血小板活化標(biāo)志物有幾個(gè)原因:(1)它僅在血小板上表達(dá)；(2)血栓形成患者血漿sGPⅥ水平升高；(3)sGPⅥ的產(chǎn)生依賴于血小板活化；(4)血漿sGPⅥ水平不受性別和吸煙的影響[19，24]。如今利用sGPⅥ評(píng)估患者的血小板水平被臨床廣泛地應(yīng)用。在心血管疾病中，已有研究顯示sGPⅥ可作為診斷中風(fēng)、穩(wěn)定型心絞痛、急性冠脈綜合征等疾病的標(biāo)志物[25-28]，亦可作為判斷服藥前后血小板活化的指標(biāo)。臨床研究發(fā)現(xiàn)[29]服用抗Xa非抗維生素K口服抗凝藥(抗Xa NOACs)阿哌沙班、利伐沙班和華法林，利用體外sGPⅥ評(píng)估抗血小板活性，提示NOACs具有抗血小板活性。83例整形外科的患者服用依度沙班以預(yù)防深靜脈血栓(DVT)，術(shù)后患者在撤掉抗凝藥后，檢測(cè)D-二聚體對(duì)判斷患者是否具深靜脈血栓意義不大，但sGPⅥ的水平可評(píng)估患者DVT的風(fēng)險(xiǎn)[30]。活體肝移植術(shù)后sGPⅥ水平的變化則可評(píng)估血小板活化和血小板減少癥之間的關(guān)系[31]。在痛風(fēng)、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和健康志愿者中，sGPⅥ水平可評(píng)估痛風(fēng)患者或者痛風(fēng)發(fā)作期時(shí)血小板活化狀態(tài)，血漿sGPⅥ在血漿風(fēng)濕性檢驗(yàn)中呈陽性患者中為一顯著的血小板活化標(biāo)志物[32]。肝硬化患者同健康志愿者相比[33]，sGPⅥ水平顯著升高，sGPⅥ水平升高同血小板數(shù)目具相關(guān)性，研究顯示補(bǔ)償性肝硬化時(shí)血小板的活化狀態(tài)。相較于非肝切除術(shù)的肝硬化患者，sGPⅥ/血小板比例對(duì)肝硬化切除術(shù)組在肝切除術(shù)前后中均明顯增高[34]。臨床上兩組隊(duì)列比較研究發(fā)現(xiàn)，sGPⅥ較D-二聚體同病死率的相關(guān)性更密切，可預(yù)測(cè)膿毒癥的進(jìn)展和病死率[35]。艾滋病病毒攜帶者發(fā)生心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)與核苷酸逆轉(zhuǎn)藥物(逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)的使用有關(guān)。艾滋病服藥方案改變時(shí)(ABC/3TC)，sGPⅥ可發(fā)生顯著變化，且變化同血小板功能的改變是一致的，其可作為艾滋病感染患者治療風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物[36]。眾多研究表明GPⅥ可作為血小板活化的診斷標(biāo)志物，但由于檢測(cè)血小板活化的敏感性及其在血中清除率的手段有限[24]，因此，sGPⅥ仍需要開發(fā)簡(jiǎn)便、快捷、精密度高的檢測(cè)方法和相關(guān)試劑。

5 展望

綜上所述，各研究均表明血小板GPⅥ在不同疾病的診斷中均具有重要意義，但目前仍缺乏大型的隊(duì)列研究和長(zhǎng)期的跟蹤調(diào)查研究。除需深入研究血小板特異性GPⅥ的結(jié)構(gòu)活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、GPⅥ脫落的機(jī)制以及診斷和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展外，還需對(duì)患者sGPⅥ與疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸間的相關(guān)性、用藥前后sGPⅥ的表達(dá)量變化進(jìn)行對(duì)比研究，為GPⅥ作為新的血小板活化診斷標(biāo)志物提供科學(xué)的理論依據(jù)。