長(zhǎng)鏈非編碼RNA與子宮內(nèi)膜異位癥關(guān)系的研究進(jìn)展

崔糧驛，王丹丹，陳思蕾，楊清

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是一種以子宮內(nèi)膜基質(zhì)和腺體出現(xiàn)在宮腔以外部位為特征的婦科疾病[1]。EMs的發(fā)病機(jī)制是多因素的，激素、免疫、環(huán)境及遺傳因素等都與其相關(guān)，盡管確切的發(fā)病機(jī)制仍不明確，但遺傳因素發(fā)揮了重要作用，尤其是表觀遺傳學(xué)因素[2-3]。

人類(lèi)基因組中，約98%為非蛋白編碼序列，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物組成了龐大復(fù)雜的非編碼RNA（ncRNAs），既往學(xué)者們把這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物解釋為無(wú)意義的轉(zhuǎn)錄碎片，但近年來(lái)學(xué)者們認(rèn)識(shí)到這些ncRNAs可以參與人類(lèi)的很多病理生理學(xué)過(guò)程。根據(jù)ncRNAs的長(zhǎng)度，可以將其分為短鏈ncRNAs和長(zhǎng)鏈ncRNAs（lncRNAs）。短鏈ncRNA長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸，如微小RNA（miRNAs）[4]，而lncRNAs含有超過(guò)200個(gè)核苷酸。根據(jù)與蛋白編碼基因的相對(duì)位置關(guān)系，lncRNAs可以分為5類(lèi)：①正義lncRNAs，即與編碼基因的1個(gè)或多個(gè)外顯子重疊；②反義lncRNAs，轉(zhuǎn)錄方向與相鄰基因轉(zhuǎn)錄方向相反，至少有1個(gè)外顯子與基因重疊；③雙向lncRNAs，與蛋白編碼基因啟動(dòng)子相同，但轉(zhuǎn)錄方向相反；④內(nèi)含子lncRNAs，由基因的內(nèi)含子產(chǎn)生；⑤基因間lncRNAs，由位于蛋白編碼基因之間的序列轉(zhuǎn)錄而來(lái)[5]。lncRNAs能在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)，并參與了X染色體基因沉默、基因組印跡及染色質(zhì)修飾等重要調(diào)控過(guò)程，在多種腫瘤的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促癌或抑癌功能。而近年越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與EMs的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān)。

1 多種lncRNAs在EMs組織中存在差異表達(dá)

2014年，Sun等[6]利用基因芯片技術(shù)對(duì)比了4例EMs患者的異位內(nèi)膜組織及配對(duì)的在位內(nèi)膜組織中l(wèi)ncRNAs和mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有948個(gè)lncRNAs存在著差異表達(dá) [差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞2，P＜0.05]，其中527個(gè)lncRNAs上調(diào)，421個(gè)下調(diào)。該研究還通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)在其余21例EMs患者的標(biāo)本中驗(yàn)證了此芯片結(jié)果，其中上調(diào)最顯著的是CHL1-AS2（FC=135.3），下調(diào)最顯著的是LOC100505776（FC=363.7）。2015年，Wang等[7]通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)比了3例EMs患者的在位內(nèi)膜組織及3例正常內(nèi)膜組織中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1 277個(gè)lncRNAs存在差異表達(dá)（FC＞2，P＜0.05），其中488個(gè)lncRNAs上調(diào)，789個(gè)下調(diào)。上調(diào)最顯著的是AC068282.3（FC=31.3），下調(diào)最顯著的是RP11-403H13.3（FC=44.3），芯片結(jié)果也經(jīng)過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證。該課題組進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，AC002454.1可以通過(guò)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)內(nèi)膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲，進(jìn)而參與EMs的發(fā)病過(guò)程[8]。2018年Cui等[9]通過(guò)對(duì)5例EMs患者的在位內(nèi)膜組織及5例正常內(nèi)膜組織進(jìn)行RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，有88個(gè)lncRNAs存在差異表達(dá)，其中33個(gè)上調(diào)，55個(gè)下調(diào)。其中上調(diào)最顯著的是SNORD3A（FC=3.0），下調(diào)最顯著的是ABO（FC=2.0）。

2 EMs與全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association studies，GWAS）

GWAS是通過(guò)全基因組測(cè)序的手段發(fā)現(xiàn)在某一特定人群中遺傳突變與表型（疾?。┲g的相關(guān)性[10]。目前，有關(guān)EMs的GWAS已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與EMs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)，這些SNP大多數(shù)位于基因的非編碼序列，尤其是編碼lncRNAs的序列[11]。其中最值得注意的是位于9號(hào)染色體上的SNP rs10965235，該SNP位于細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑2B反義RNA（CDKN2B-AS）基因的內(nèi)含子6中，編碼lncRNA CDKN2B-AS。目前的研究發(fā)現(xiàn)，SNP rs10965235與日本人[12]（P=5.57×10-12，OR=1.44）、高加索人[13]（P=1.25×10-2，OR=1.32）及韓國(guó)人[14]（P=1.30×10-4，OR=1.49）的EMs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。王彥袖[15]關(guān)于中國(guó)人的GWAS發(fā)現(xiàn)，SNPrs10965235也是中國(guó)北方婦女EMs發(fā)病的潛在危險(xiǎn)因素。但有關(guān)CDKN2B-AS在EMs發(fā)病和發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

3 lncRNAs與EMs的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialto-mesenchymal transition,EMT）

EMT是指上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性及與基底膜的連接，上皮性標(biāo)志物如鈣黏蛋白E（E-cadherin）及角蛋白（Keratin）表達(dá)量減少，間充質(zhì)標(biāo)志物如鈣黏蛋白N（N-cadherin）及波形蛋白（Vimentin）表達(dá)量增加，EMT被認(rèn)為是上皮性惡性腫瘤發(fā)展的重要過(guò)程，也與EMs的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）屬于lncRNAs，其位于染色體11q13.1，最早在非小細(xì)胞肺癌中被發(fā)現(xiàn)，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[16-18]。而最近有研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1在異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)上調(diào)。Liang等[19]的研究發(fā)現(xiàn)miR-200C可以抑制EMs的EMT過(guò)程，而MALAT1作為miR-200C的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），可以通過(guò)上調(diào)EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和ZEB2來(lái)促進(jìn)EMT過(guò)程，而Du等[20]則發(fā)現(xiàn)雌激素可以促進(jìn)這一過(guò)程。除此之外，MALAT1還可以介導(dǎo)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（endometrial stromal cells，ESCs）在缺氧誘導(dǎo)下的細(xì)胞自噬[21]，而缺氧也被認(rèn)為是EMs發(fā)病的重要促進(jìn)因素。Lin等[22]發(fā)現(xiàn)lncRNA AFAP1-AS1在EMs組織中顯著上調(diào)，敲減AFAP1-AS1可以抑制轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的啟動(dòng)子位點(diǎn)pGL3-P886的活性，并可以抑制子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，表明該作用機(jī)制可能與EMT過(guò)程相關(guān)。Mai等[23]發(fā)現(xiàn)沉默LINC01541可以通過(guò)促進(jìn)EMT過(guò)程而增強(qiáng)ESCs的侵襲能力，而過(guò)表達(dá)LINC01541可以抑制ESCs中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4 lncRNAs調(diào)控EMs細(xì)胞的生物學(xué)行為

由于EMs具有類(lèi)似惡性腫瘤的侵襲、黏附等特征，因此研究lncRNAs對(duì)EMs細(xì)胞生物學(xué)行為的影響是學(xué)者們關(guān)注的重點(diǎn)。Sha等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，LINC00261在異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，在EMs細(xì)胞系CRL-7566中過(guò)表達(dá)LINC00261后，細(xì)胞的增殖和遷移能力均出現(xiàn)明顯下降，表明LINC00261對(duì)EMs的發(fā)生、發(fā)展起到抑制作用，但具體調(diào)控機(jī)制還不明確。Liu等[25]通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了3個(gè)EMs的數(shù)據(jù)集后發(fā)現(xiàn)，LINC01279在EMs組織中表達(dá)顯著上調(diào)，并與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶14（cyclindependent kina se 14，C DK14）的表達(dá)相關(guān)，因此推測(cè)LINC01279可能參與了EMs的細(xì)胞周期調(diào)控。Zhang等[26]通過(guò)基因芯片發(fā)現(xiàn)lncRNA CCDC144NL-AS1在EMs患者的異位內(nèi)膜組織和配對(duì)的在位內(nèi)膜組織中存在著差異表達(dá)。在hEM15A（人EMs患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞系）中敲減CCDC144NL-AS1后，細(xì)胞的遷移和侵襲能力得到了抑制，但對(duì)細(xì)胞的增殖、黏附、凋亡及細(xì)胞周期沒(méi)有影響。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)敲除CCDC144NL-AS1后hEM15A細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白骨架形態(tài)發(fā)生了明顯變化，同時(shí)影響了纖維型肌動(dòng)蛋白（Fibrous actin，F(xiàn)-actin）在細(xì)胞內(nèi)的分布，提示CCDC144NL-AS1對(duì)hEM15A細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響可能與細(xì)胞骨架有關(guān)。另外，Zhang等[27]還對(duì)芯片中篩出的差異mRNA及l(fā)ncRNAs進(jìn)行了生物學(xué)信息分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mRNA細(xì)胞黏附相關(guān)分子L1樣（cell adhesion molecule L1 like，CHL1）及其對(duì)應(yīng)的2個(gè)反義lncRNAs——CHL1-AS1及CHL1-AS2存在明顯的表達(dá)相關(guān)性，據(jù)此推測(cè)其可能參與EMs的發(fā)生、發(fā)展，這與Sun等[6]的測(cè)序結(jié)果是一致的。

5 lncRNAs與EMs相關(guān)性不孕

不孕是EMs患者常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)之一，有報(bào)道稱25%～50%患有不孕癥的女性同時(shí)也患有EMs，而30%～50%的EMs患者表現(xiàn)為不孕[28]。Ghazal等[29]發(fā)現(xiàn)EMs患者的在位內(nèi)膜中l(wèi)ncRNA H19表達(dá)顯著降低，而降低的H19通過(guò)ceRNA機(jī)制增加了miRNA let-7的活性，反過(guò)來(lái)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制了胰島素樣生長(zhǎng)因子1受 體 （insulin-like growth factors 1 receptor，IGF1R）的表達(dá)，從而抑制了ESCs的增殖，據(jù)此該研究認(rèn)為EMs患者中H19/Let-7/IGF1R軸的改變可能是導(dǎo)致不孕的機(jī)制之一。此外，有研究發(fā)現(xiàn)EMs患者中下調(diào)的MALAT1可以通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂素活化蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase/mitogen active protein kinase，ERK/MAPK）信號(hào)通路來(lái)抑制卵泡顆粒細(xì)胞的增殖[30]，而上調(diào)的lncRNAENST00000433673會(huì)影響胚胎的植入[31]。但一項(xiàng)關(guān)于腹膜型EMs的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA的差異表達(dá)并不會(huì)影響不孕患者子宮內(nèi)膜的容受性[32]。

6 lncRNAs可能成為診斷EMs的分子標(biāo)志物

除了超聲可以發(fā)現(xiàn)卵巢EMs的囊腫之外，腹腔鏡探查術(shù)為診斷EMs的金標(biāo)準(zhǔn)，這導(dǎo)致EMs的確診通常要推遲5～10年之久。因此找到與EMs相關(guān)的非侵入性分子標(biāo)志物一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)，尤其是對(duì)于那些超聲下無(wú)法診斷的患者[33-34]。Wang等[35]分析了110個(gè)血清樣本和24個(gè)組織樣本中的lncRNAs差異表達(dá)譜，并利用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC曲線）評(píng)估其診斷價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EMs患者血清中的lncRNA ENST00000482343可以作為潛在的分子標(biāo)志物，ROC曲線下面積（area under the ROCcurve，AUC）為0.716（95%CI：0.618～0.814，P＜0.001），敏感度為0.724，特異度為0.717。同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合5個(gè)特定lncRNAs得到的診斷價(jià)值更高，AUC可達(dá)0.880（95%CI：0.811～0.948，P＜0.001），敏感度為0.817，特異度為0.732。Qiu等[36]發(fā)現(xiàn)EMs患者血清中外泌體lncRNA aHIFs明顯上調(diào)，并具有促進(jìn)EMs血管生成的作用，因此認(rèn)為外泌體lncRNA aHIFs也可能成為診斷EMs的分子標(biāo)志物。

7 結(jié)語(yǔ)與展望

作為體內(nèi)ncRNAs家族的重要成員，lncRNAs在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，lncRNAs的重要功能備受重視。EMs作為一種育齡期婦女常見(jiàn)的疾病，嚴(yán)重影響其生理健康，該病發(fā)病原因雖不明確，但遺傳因素在其中起到了重要作用。雖然學(xué)者們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種差異表達(dá)的lncRNAs，可能在EMs的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但具體的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。同時(shí)，若能進(jìn)一步篩選出特異度和敏感度均較高的lncRNAs，將極大程度地推進(jìn)EMs的早期診斷。