檳榔堿對生殖與泌尿系統(tǒng)的影響

周思安，劉斯薇，金力行，龍一婧，趙靈逸，權(quán)艷梅，丁之德

檳榔（Areca nut）是檳榔樹（Areca catechu L.）的果實(shí)，原產(chǎn)于印度、中國臺灣地區(qū)和南太平洋的眾多島國。全世界擁有數(shù)億人以各種形式消費(fèi)檳榔，亞太地區(qū)尤為普遍[1]。檳榔常作為中藥成分，被用于利尿消積、防治寄生蟲、治療消化不良等方面[2-3]。然而，檳榔具有強(qiáng)烈的致癮性，是世界上僅次于尼古丁、乙醇和咖啡因且消費(fèi)最為廣泛的成癮物質(zhì)。目前，全世界約有10%的人口消費(fèi)檳榔。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，檳榔同樣具有嚴(yán)重的生物毒性和致癌性，可導(dǎo)致多種疾病和癌癥的發(fā)生。檳榔國際癌癥研究中心（IARC）于2004年將檳榔歸類列為第一類致癌物，其易誘發(fā)口腔癌，如湖南省是我國食用檳榔人群的主要省份，而該省口腔癌發(fā)病率明顯高于其他的地區(qū)。近期流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)，湖南省超過90%的口腔癌患者的發(fā)病與食用檳榔有關(guān)[4-5]。雖然檳榔的化學(xué)成分復(fù)雜且不同地區(qū)食用檳榔的方式不同，但研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致其生物毒性和致癌性的主要成分為生物堿，即檳榔堿（N-methyl-1，2，5，6-tetrahydropyridine-3-carboxylic acid methyl ester）、檳榔次堿、去甲檳榔堿和去甲檳榔次堿。其中，以檳榔堿的毒副作用最為顯著。

近年來，對檳榔的研究已不僅局限于對于口腔疾病及相關(guān)腫瘤的了解，而是進(jìn)一步轉(zhuǎn)向了解其對于人體內(nèi)其他各主要系統(tǒng)及器官的危害，包括神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)[6-7]，如在檳榔盛產(chǎn)地區(qū)，男（雄）性生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)疾病的發(fā)病率逐漸提升，可能是該類人群咀嚼檳榔所導(dǎo)致的危害之一。研究表明檳榔堿可以影響精子發(fā)生，減少精子數(shù)量，影響精子形態(tài)和鞭毛運(yùn)動能力并且還與慢性腎?。–KD）有關(guān)。檳榔堿影響男（雄）性生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的主要作用機(jī)制包括誘導(dǎo)生殖細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及誘導(dǎo)生殖系統(tǒng)與泌尿系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，影響性激素睪酮的正常分泌及誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化等。另有流行病學(xué)調(diào)查表明，檳榔堿會對女性妊娠結(jié)局產(chǎn)生不良影響，如新生兒男女比例失調(diào)、新生兒體質(zhì)量減輕及死亡等[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，檳榔堿和檳榔提取物（areca nut extract，ANE）可致禽類、小鼠和斑馬魚等胚胎毒性及損傷倉鼠卵細(xì)胞[9-10]。

1 檳榔堿對男（雄）性生殖系統(tǒng)的影響

1.1 檳榔堿與氧化應(yīng)激 檳榔堿損害男（雄）性生殖系統(tǒng)的一個重要途徑是對生殖細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激指組織或細(xì)胞內(nèi)大量氧化中間產(chǎn)物堆積、氧化與抗氧化動態(tài)平衡被打破，平衡更傾向于氧化一方，進(jìn)而對組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷[7]。氧化應(yīng)激的主要表現(xiàn)為氧化中間產(chǎn)物如活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）等產(chǎn)量增加、抗氧化作用代償性激活等。正常條件下，ROS參與部分生理活動，如細(xì)胞信號傳導(dǎo)（cell signaling），但作為一種氧代謝的副產(chǎn)物，過量ROS的生成最終會導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生，進(jìn)而引起組織損傷[11]。在生殖系統(tǒng)中，雖無檳榔堿直接導(dǎo)致氧化應(yīng)激的相關(guān)結(jié)論，但已有研究提示生殖系統(tǒng)和ANE慢性接觸與該系統(tǒng)ROS增高引起的氧化應(yīng)激有關(guān)[12]。這種相關(guān)性主要表現(xiàn)在其組織的脂質(zhì)過氧化過度激活、細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制相應(yīng)激活和唾液酸（sialic acid）含量下降3個方面。

睪丸組織和精子質(zhì)膜由于富含多元不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids），更容易受ROS破壞，進(jìn)而影響生精過程。有研究表明，經(jīng)檳榔提取物處理的小鼠睪丸、附睪組織及精子內(nèi)脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物丙二醇（malondialdehyde，MDA）含量均有升高[12]。這一結(jié)果提示，檳榔提取物可能通過促進(jìn)睪丸、附睪及精子膜的脂質(zhì)過氧化破壞生精過程。同時，酶抗氧化劑，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）等均與細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制有關(guān)。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生過量ROS時，細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制激活，SOD首先將超氧自由基轉(zhuǎn)化為羥基自由基（HO·），隨后CAT將HO·轉(zhuǎn)化為氧分子（O2），以此保護(hù)組織細(xì)胞免受過量ROS損傷。研究顯示，經(jīng)過檳榔提取物處理的小鼠體內(nèi)SOD含量在前期升高而后期逐漸降低，此時體內(nèi)由提取物誘發(fā)產(chǎn)生的過量超氧自由基大部分被轉(zhuǎn)化為HO·，而CAT受過量HO·刺激激活，含量卻持續(xù)上升[12]。

此外，唾液酸又稱N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetyl neuraminic acid），通過自身攜帶的活性巰基（-SH）清除ROS（如H2O2、HO·等）也可發(fā)揮一定的抗氧化作用。研究表明唾液酸含量與附睪中精子成熟和膜結(jié)構(gòu)完整性的維持有關(guān)。經(jīng)檳榔提取物處理過的小鼠，其睪丸和附睪尾部組織中的唾液酸含量均有所降低。唾液酸含量下降使得其抗氧化損傷作用減弱，進(jìn)一步導(dǎo)致精子數(shù)量與活動力降低，精子頂體反應(yīng)與受精能力下降[13]。

1.2 檳榔堿與炎癥 目前發(fā)現(xiàn)許多免疫細(xì)胞因子與男（雄）性生殖息息相關(guān)。細(xì)胞因子參與正常生殖的生理過程，同時也是精漿中重要的成分。然而，精液中過量的免疫細(xì)胞因子可導(dǎo)致一系列病理發(fā)生，如精子數(shù)量、精子質(zhì)量參數(shù)及精子遺傳物質(zhì)完整性改變，并與精子發(fā)生的微環(huán)境密切相關(guān)[14-15]。其中，許多促炎癥細(xì)胞因子的過度表達(dá)與男（雄）性不育存在關(guān)聯(lián)。白細(xì)胞介素6（IL-6）能導(dǎo)致精子DNA完整性的破壞，從而進(jìn)一步影響精卵識別和受精過程；IL-8在少精子癥、弱精子癥患者的精漿中含量顯著上升[16]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)檳榔堿刺激后，促炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等水平顯著增高，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)和組織纖維化[17]。

除促炎癥因子的介導(dǎo)作用之外，環(huán)氧合酶2（COX-2）也在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。COX-2是經(jīng)炎癥刺激后迅速產(chǎn)生的誘導(dǎo)酶，也是前列腺素合成初始步驟中的關(guān)鍵限速酶，其可激活前列腺素相關(guān)的炎癥反應(yīng)[18-19]。體外實(shí)驗(yàn)表明，檳榔堿濃度與COX-2表達(dá)量呈正相關(guān)，且COX-2高表達(dá)精子的活動力等參數(shù)在檳榔堿的作用下顯著下降[20]。

另外，檳榔堿能夠以直接和間接的方式破壞睪丸血睪屏障結(jié)構(gòu)。表面緊密連接蛋白1（ZO-1）是血睪屏障中重要的緊密連接蛋白，也是血睪屏障被破壞的重要位點(diǎn)[21]。研究表明，在用檳榔堿處理過的TM4細(xì)胞（小鼠Sertoli細(xì)胞系）和THP-1（人白血病單核細(xì)胞）中，檳榔堿能夠通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）通路直接下調(diào)ZO-1的表達(dá)，破壞血睪屏障結(jié)構(gòu)。除此之外，檳榔堿還可通過激活ERK1/2通路上調(diào)TNF-α表達(dá)，而TNF-α能夠進(jìn)一步下調(diào)血睪屏障中連接蛋白如閉合蛋白（occludin）、ZO-1及N-鈣黏著蛋白（N-cadherin）的表達(dá)，破壞血睪屏障，最終導(dǎo)致男（雄）性不育[22]。

1.3 檳榔堿與性激素 男（雄）性生殖系統(tǒng)中的主要性激素為睪酮及其衍生物。睪酮是睪丸Leydig細(xì)胞中雄甾烷類類固醇合成途徑的最終產(chǎn)物[23]，正常水平的睪酮對男（雄）性生殖系統(tǒng)發(fā)育和代謝具有重要意義。然而，檳榔堿可刺激過度的睪酮合成和分泌。其作用途徑與促性腺激素不同，后者利用環(huán)磷酸腺苷（cAMP）作為第二信使促進(jìn)睪酮生成，而檳榔堿的作用機(jī)制主要表現(xiàn)為以下多種方式：①檳榔堿可通過上調(diào)TNF-α的表達(dá)刺激睪丸Leydig細(xì)胞分泌睪酮。研究表明經(jīng)過TNF-α處理的睪丸Leydig細(xì)胞其睪酮含量明顯上升。同時，經(jīng)檳榔堿共培養(yǎng)的TM4細(xì)胞中，TNF-α的mRNA表達(dá)明顯增加，且其蛋白表達(dá)也顯著上升[24]。②檳榔堿可活化17β-羥類固醇脫氫酶（17β-HSD） 和膽固醇側(cè)鏈裂解酶（P450scc）的活性、提高類固醇快速調(diào)節(jié)蛋白（StAR蛋白）的表達(dá)等直接作用于睪丸Leydig細(xì)胞，增加Leydig細(xì)胞睪酮分泌，使血漿睪酮水平明顯上升[25]。由于P450scc催化膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，因此P450scc是影響類固醇合成的重要因素。另一方面，雄烯二酮可在17β-HSD的作用下轉(zhuǎn)換為睪酮，由此可見17β-HSD和P450scc活性對于睪酮的生成至關(guān)重要[26-27]。研究表明檳榔堿可以通過提高17β-HSD和P450scc的活性，加速睪酮的類固醇合成途徑，從而使睪酮的分泌進(jìn)一步增加[25]。類固醇激素合成過程中，膽固醇會被轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜，此過程為類固醇激素合成中的限速步驟。StAR蛋白在轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇從線粒體外膜進(jìn)入內(nèi)膜的過程中起關(guān)鍵作用[28]。檳榔堿可以通過上調(diào)StAR蛋白的表達(dá)提高從線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)膜的膽固醇，從而增加Leydig細(xì)胞的睪酮合成和分泌，提高機(jī)體的睪酮水平[25]。③細(xì)胞膜上鈣離子通道的轉(zhuǎn)運(yùn)會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子水平升高，此過程也與睪丸Leydig細(xì)胞的睪酮分泌密切相關(guān)。檳榔堿可以通過激活大鼠Leydig細(xì)胞中的L-型鈣通道，促進(jìn)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高睪酮的分泌作用[25]。

值得一提的是，雖有文獻(xiàn)表明在體外培養(yǎng)中，檳榔堿對于促性腺激素釋放激素（GnRH）介導(dǎo)的黃體生成激素（LH）沒有顯著影響，但同時也有實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)過檳榔堿處理的大鼠，血清中LH和卵泡刺激素（FSH）含量明顯升高，顯著升高的血清LH可進(jìn)一步刺激睪丸Leydig細(xì)胞合成和分泌睪酮，使血清內(nèi)睪酮含量升高[25]。

2 檳榔堿對女性生殖系統(tǒng)與妊娠的影響

2.1 檳榔堿與卵細(xì)胞受損 Lin等[29]在對中國倉鼠卵細(xì)胞（Chinese hamster ovary cells，CHO-K1）的研究發(fā)現(xiàn)，檳榔提取物以時間劑量依賴的方式，通過誘發(fā)氧化應(yīng)激，生成過量ROS等降低CHO-K1細(xì)胞的活力并抑制其增殖，但有關(guān)檳榔提取物或檳榔堿對卵細(xì)胞損傷的機(jī)制目前仍相對缺乏。

2.2 檳榔堿與妊娠 多項(xiàng)流行病學(xué)研究表明，孕婦長期咀嚼檳榔會導(dǎo)致新生兒出生結(jié)局（birth outcome）受影響，如新生兒體質(zhì)量減輕和嬰兒死亡等。Deb等[8]對195名妊娠婦女進(jìn)行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，妊娠期每日攝入生檳榔的劑量與其分娩的嬰兒死亡率有顯著關(guān)聯(lián)，嬰兒死亡率高的生育女性其檳榔攝入量明顯高于對照組。Logistic回歸分析顯示，妊娠婦女每天攝入4枚或更多檳榔與其分娩的嬰兒死亡經(jīng)歷（infant-death-experiences）獨(dú)立相關(guān)（a OR=8，95%CI：1.9～34.3，P=0.005）[8]。世界衛(wèi)生組織（WHO）認(rèn)為高碳水化合物攝入和低硫胺素（thiamine）攝入的人群易出現(xiàn)輕度硫胺素缺乏癥，而檳榔也被確定為一類抗硫胺素物質(zhì)。因此，WHO同時強(qiáng)調(diào)攝入檳榔的妊娠婦女生育后其幼嬰在第2～5個月的死亡與硫胺素缺乏高度相關(guān)。Berger等[30]調(diào)查了1 171例帕勞妊娠婦女也發(fā)現(xiàn)，在咀嚼檳榔和吸煙者的足月新生兒有出生體質(zhì)量偏低的風(fēng)險（OR=2.4，P=0.049）。

但需要指出的是，Chue等[31]回顧性分析了1997年7月—2006年11月在泰緬邊境產(chǎn)前診所登記的9 264名移民或難民妊娠婦女的常規(guī)記錄，發(fā)現(xiàn)僅食用檳榔的妊娠婦女其新生兒平均體質(zhì)量較既不食用檳榔也不吸煙者高51 g（95%CI：21～80 g，P=0.001），但是兩者新生兒低出生體質(zhì)量（lowbirthweight，LBW）發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（12.3%vs.10.4%）。此外，該研究對新生兒LBW的誘因進(jìn)行單變量檢驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，食用檳榔與不食用檳榔的妊娠婦女相比較，新生兒LBW的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.264）。該研究認(rèn)為其統(tǒng)計結(jié)果與其他研究的差異在于，其他研究樣本量偏小，不能控制樣本誤差。但該研究同時也指出，亞洲不同地區(qū)居民食用檳榔具體方式的不同會影響研究結(jié)果，故確認(rèn)咀嚼檳榔對妊娠的影響仍需更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牧餍胁W(xué)調(diào)查設(shè)計及相應(yīng)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)加以佐證。

2.3 檳榔堿與胚胎毒性 在禽類、小鼠和斑馬魚等多種動物胚胎模型中，檳榔堿均表現(xiàn)出明顯的胚胎毒性[9，10]。其中，Chang等[9]在深入研究斑馬魚模型后發(fā)現(xiàn)，檳榔堿并不通過p53-p21通路損傷細(xì)胞，而是主要通過清除細(xì)胞內(nèi)硫醇（thiol），如谷胱甘肽（glutathione，GSH）及其前體N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）產(chǎn)生胚胎毒性，影響胚胎發(fā)育，而通過向受檳榔堿影響的胚胎中添加GSH或NAC可以使胚胎恢復(fù)正常發(fā)育。

GSH是一種由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸組成的三肽，也是真核細(xì)胞中含量最高的硫醇。腸半胱氨酸（enteral cysteine）、腸外半胱氨酸（parenteral cysteine）、甲硫氨酸（methionine）、NAC等均為組織合成GSH的前體[10]。過量的ROS通過與組織蛋白中半胱氨酸上的巰基（-SH）結(jié)合，氧化破壞該蛋白。GSH通過與過量的ROS結(jié)合生成混合二硫化物（mixed disulfides，-SSG）保護(hù)組織蛋白，以此參與細(xì)胞的抗氧化防御[32]。因此，GSH具有結(jié)合活性代謝物或與之反應(yīng)，并清除多余活性代謝物的作用，可參與細(xì)胞的抗氧化防御。同時，GSH也參與多個細(xì)胞進(jìn)程（cellular process）。檳榔堿通過與GSH直接結(jié)合，減少了細(xì)胞內(nèi)GSH含量，削弱了GSH抗氧化的作用，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

此外，研究還顯示檳榔堿作用于毒蕈堿受體（muscarinic receptor） 和煙堿酸受體（nicotinic receptor），可進(jìn)一步導(dǎo)致胚胎心臟功能不全。這種由檳榔堿誘發(fā)的心功能不全也是胎兒后期（later phase）死亡的一個重要誘因[9]。

3 檳榔堿對泌尿系統(tǒng)的影響

檳榔堿可誘導(dǎo)小鼠慢性腎小管間質(zhì)纖維化，從而導(dǎo)致CKD的發(fā)生，但分子機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。此外，研究表明檳榔堿還可影響非肌肉浸潤性膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer）患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險[33-34]。

3.1 檳榔堿與CKD CKD的特征是進(jìn)行性腎纖維化，包括腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化，其可表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞損傷，纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI1）和細(xì)胞外基質(zhì)如膠原蛋白和纖維連接蛋白等積聚。檳榔堿可增加細(xì)胞中促纖維化的PAI1、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和COX2的表達(dá)[35]。檳榔堿具有細(xì)胞毒性，并通過JNK增加TGF-β和促纖維化蛋白（纖連蛋白和PAI1）的表達(dá)、增加TGF-β基因轉(zhuǎn)錄水平和活性TGF-β1水平誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化，損傷近端腎小管細(xì)胞，而COX2是炎性腎損傷的主要介質(zhì)之一[36]。

3.2 檳榔堿與膀胱癌 對非肌肉浸潤性膀胱癌患者的臨床研究表明，戒除咀嚼檳榔的習(xí)慣可降低非肌肉浸潤性膀胱癌患者首次復(fù)發(fā)的風(fēng)險。此外，這對于該類患者腎功能的保留也可能有益[34]。檳榔和其成分經(jīng)歷代謝活化和亞硝化最終產(chǎn)生致癌物，導(dǎo)致正常細(xì)胞DNA突變和DNA鏈斷裂，并會致使腫瘤抑制基因如P53、乳腺癌易感基因1（BRCA1）和BRCA2表達(dá)形式改變。另一方面，檳榔堿在牙齦上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）和MMP-9分泌，促進(jìn)腫瘤進(jìn)一步發(fā)展[36]，該機(jī)制在膀胱癌細(xì)胞中也存在。上述因素均加速了癌癥的復(fù)發(fā)。同時，檳榔堿也會通過誘導(dǎo)代謝綜合征的發(fā)生間接導(dǎo)致膀胱癌的惡化[37]。

4 結(jié)語與展望

綜上所述，檳榔會通過氧化應(yīng)激機(jī)制、炎癥機(jī)制和激素機(jī)制降低精子質(zhì)量參數(shù)、刺激睪丸Leydig細(xì)胞異常分泌睪酮、促進(jìn)COX-2高表達(dá)、破壞血睪屏障和誘導(dǎo)CKD及膀胱腫瘤復(fù)發(fā)等。我國是檳榔生產(chǎn)及消費(fèi)的主要國家之一，雖然檳榔生物堿致口腔腫瘤的危害已被醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)識，同時也逐漸引起各地管理機(jī)構(gòu)的關(guān)注，如近期湖南省檳榔食品行業(yè)協(xié)會已被要求停止其所屬企業(yè)有關(guān)檳榔制品在國內(nèi)的廣告宣傳。然而，現(xiàn)階段檳榔堿對生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)的影響卻還遠(yuǎn)未引起足夠重視，同樣相對應(yīng)的基礎(chǔ)研究也相對缺乏，這就需要提升廣大醫(yī)務(wù)人員及公眾對檳榔的危害有更廣泛而足夠的認(rèn)識。