非編碼RNA與卒中研究進展*

馬蓉， 徐弘揚， 楊錫彤， 王光明△

1大理大學臨床醫(yī)學院(云南大理 671000)； 2大理大學第一附屬醫(yī)院基因檢測中心(云南大理 671000)

腦卒中是威脅生命的疾病，是發(fā)展中國家和發(fā)達國家導致殘疾的主要原因，缺血性卒中由于腦血流量供應減少，造成腦組織氧和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，最終導致神經(jīng)元細胞死亡和腦梗死。根據(jù)腦卒中的高發(fā)病率、高病死率、高致殘率、高復發(fā)率以及并發(fā)癥多的特征。腦卒中與冠心病、癌癥并列為威脅人類健康的三大疾病之一。2016年《中國腦卒中防治報告》報道：我國現(xiàn)有腦卒中患者7 000萬人，不同地區(qū)的卒中年齡標準化患病率為(260～719)/10萬人，每年新發(fā)卒中200萬人，而每年卒中致死人數(shù)高達165萬人，占所有其他原因死亡人數(shù)的22.45%[1]。在中國，約75%急性腦卒中患者是缺血性卒中[2]。幸存的腦卒中患者往往會伴隨著殘疾和勞動能力的喪失，對社會經(jīng)濟造成負擔[3]。且隨著人口老齡化的不斷擴大，腦卒中對中國的公共衛(wèi)生系統(tǒng)造成的負擔相應的增加。由于卒中涉及的病理生理級聯(lián)反射復雜多樣，導致目前卒中的臨床治療研究進展緩慢。為了進一步闡明腦卒中發(fā)病的分子機制，目前非編碼RNA(noncoding RNAs，ncRNAs)在腦卒中中的作用得到了闡述。本文就ncRNAs在卒中患者中的作用及其相關機制進行綜述。

1 ncRNAs概述

ncRNAs來源于非翻譯或非轉(zhuǎn)錄區(qū)和內(nèi)含子的不編碼蛋白質(zhì)的RNA[4]。一般來說，根據(jù)鏈的長短次序長度小于200 bp的RNA稱為小ncRNAs，長度大于200 bp的RNA稱為長ncRNAs[5]。目前，ncRNAs被認為是體內(nèi)代謝、發(fā)育和分化等各種生理和生物學反應的重要介質(zhì)，也與機體的某些病理狀態(tài)有關[6]。在缺血性損傷后對神經(jīng)元修復中各種ncRNAs有積極的作用，且與ncRNAs相關的治療技術已經(jīng)應用于心血管疾病，不同類型的ncRNAs對預防心肌細胞死亡及促進血管生成有積極的作用[7]。因此，用各種類型ncRNAs的組合對缺血性卒中的病理學進行標記或?qū)ψ渲兄委熯M行探討，本文將集中討論3個家族的ncRNAs在卒中中的活動和已知的關聯(lián)：微小RNA(microRNAs，miRNAs)，它們控制轉(zhuǎn)錄后基因表達；長非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)，它們在基因組維持中起作用；環(huán)形RNAs(circular RNAs，circRNAs)在基因表達中起調(diào)控作用。

2 miRNAs與腦卒中

miRNAs是普遍存在的、內(nèi)源性的非編碼短單鏈RNA，其長度通常為19～25個核苷酸，其通過與3-非翻譯區(qū)(3-UTR)結(jié)合以序列依賴的方式介導轉(zhuǎn)錄后基因沉默[8]。在大腦中，神經(jīng)元網(wǎng)絡的復雜性和可塑性以及神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的功能特異性都依賴于高度組織化和協(xié)調(diào)化的基因表達。據(jù)估計，至少有30%的蛋白質(zhì)編碼基因受miRNAs調(diào)節(jié)[9]。有數(shù)據(jù)表明，miRNAs在腦內(nèi)的表達受控于時間和空間，它在突觸可塑性、神經(jīng)元分化和發(fā)育等方面有一定的作用[10]。目前，已建立了多種用于研究大腦和血液中的miRNAs的調(diào)控作用及神經(jīng)保護作用的實驗模型。在小鼠和人腦中發(fā)現(xiàn)存在特異性的miRNA-9、-124、-124a、-128、-135、-153、-185和-219，且指出腦缺血時miRNA-9、-124和-128下調(diào)，其余5種無明顯變化[4]。此外，循環(huán)miRNAs在不同的卒中患者中的表達有所差異[11]。最近的研究主要集中在miRNAs作為腦卒中生物標志物的作用以及作為調(diào)控卒中級聯(lián)相關通路中大量基因的靶點等方面。因此，miRNAs作為卒中新型的生物標志物以及潛在的治療靶點備受關注。

目前研究認為，miRNAs參與了人類約1/3基因的表達調(diào)控，其基因調(diào)節(jié)功能使它們成為疾病的潛在候選標志物。Mirzaei等[11]也闡述了基于miRNAs的腦卒中治療的應用、治療的潛在機制以及通過靶向特異性miRNAs預防卒中損傷的藥物制劑等，有了以上理論基礎，較少被研究的2個ncRNA組在卒中后腦血管病理生理學中的功能意義和機制也將得到更多的研究。在中腦動脈閉塞的大鼠模型中，使用miRNAs芯片技術鑒定了缺血性損傷的腦中miRNAs的變化情況，在缺血再灌注后3 h，miR-140、miR-145和miR-331逐漸增加，缺血再灌注后3 d內(nèi)，miR-140、miR-145和miR-331逐漸增加，而miR-153、miR-29c、miR-98、miR-204等多個miRNA的表達逐漸降低[12]。腦缺血后miRNA的變化表明miRNAs可能在腦缺血早期應激反應中作為細胞存活的負或正調(diào)節(jié)因子在起作用。用神經(jīng)元細胞培養(yǎng)實驗證明多個miRNAs(miR-200b，miR-200c，miR-429)本身具有細胞保護作用，用中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，miR-181的區(qū)域表達變化與腦血流分布呈負相關，并且抗miR-181可以保護腦免受缺血損傷[13]。在大鼠中腦動脈閉塞的模型中顯示miR-23a的表達水平有性別差異，部分解釋了卒中發(fā)病機制的性別差異[14]。這些發(fā)現(xiàn)證明了miRNAs轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的復雜性，其表達的改變對細胞生存或者死亡都有影響。因此，miRNAs作為新的生物標志物和作為卒中治療干預的潛在靶點具有很好的前景。

miRNAs作為基因表達的關鍵調(diào)控因子，不僅為生物標志物的研究還為缺血性疾病的治療開辟了新的研究領域。但miRNAs親水性強不易跨越血腦屏障，此外，miRNAs穩(wěn)定性不如DNA，因此，miRNAs治療腦卒中的潛在用途受到了包括血腦屏障滲透和穩(wěn)定性的若干因素的影響。通過化學修飾等技術可以改變miRNAs的穩(wěn)定性和跨越血腦屏障的能力，從而為miRNAs在卒中方面的應用研究提供了一定的支持。作為預防或治療卒中的生物分子，miRNA在人體內(nèi)的量應該具有可操作性，其增加或減少大腦中miRNAs含量的技術方法處于實驗室嘗試階段。鑒于缺血性卒中病理生理分子信號的復雜性，單一基因的靶向治療干預在臨床上失敗也是常有的。具有調(diào)節(jié)大量進化保守編碼基因的能力的靶向非編碼基因如miRNAs，在未來基因治療方面是極具代表性的。

3 lncRNAs與卒中

lncRNAs是一類較長的ncRNAs。它們種類繁多，數(shù)量眾多，至今已鑒定出的人類的lncRNAs超過50 000個[15]。在多發(fā)性疾病方面，lncRNAs在包括表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后控制等的發(fā)生發(fā)展相關的蛋白質(zhì)編碼基因表達水平調(diào)控以及相關信號通路的調(diào)控方面起著關鍵的作用。lncRNAs作為一種新型的具有生物學功能的臨床生物標志物，具有廣泛的臨床應用前景。依據(jù)它們的結(jié)構特征，lncRNAs可以直接結(jié)合同源基因組DNA和RNA。lncRNAs也可以通過形成復雜的二級結(jié)構與許多蛋白質(zhì)相互作用。近年來，lncRNAs在分子功能中的重要作用得到了廣泛的研究，包括RNA加工、轉(zhuǎn)錄以及基因表達和作為小RNAs前體的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，很明顯，lncRNAs參與了許多重要的生物學過程，如細胞存活、增殖、分化、染色質(zhì)重塑和器官的形成[16]。

近年來，越來越多的證據(jù)表明lncRNAs在缺血性卒中的發(fā)病中起著關鍵性的作用，某些lncRNAs在缺血性卒中的體外和體內(nèi)的差異隨時間而改變，并可作為生物標志物廣泛應用于臨床。在嚙齒動物卒中模型和中風患者[17]的血液樣本中也發(fā)現(xiàn)了lncRNAs水平的改變，并且可以作為潛在的標志物。血液樣品中l(wèi)ncRNAs水平變化，提示循環(huán)lncRNAs可能是反映腦的病理生理狀態(tài)的一個有前景的標志物。最近的研究表明，lncRNAs下游轉(zhuǎn)錄因子c-fos(Fos downstream transcript，F(xiàn)osDT)通過與神經(jīng)元限制性沉默因子(repressor element silencing transcription factor，REST)相關的染色質(zhì)修飾蛋白相互作用來促進缺血性腦損傷[18]，lncRNAs也可通過調(diào)節(jié)REST下游的基因來治療卒中后偏癱，提示lncRNAs可以作為治療靶點，以減少卒中后的腦損傷。其他的lncRNAs如SNHG14、TUG1等也被報道能介導缺血誘導的神經(jīng)元死亡、神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)恢復[19-20]。有研究[2]指出，H19基因的多態(tài)性增加了缺血性腦卒中患者的缺血性卒中風險，提示lncRNAs H19可能是缺血性腦卒中的一個新的診斷或治療靶點。但關于lncRNAs的探究仍然面臨多方面的挑戰(zhàn)。就如lncRNAs功能上的復雜性就阻礙了對其分子機制的研究，而且許多l(xiāng)ncRNAs只在靈長類中表達。即使我們已經(jīng)證實了其部分的分子機制，但這在臨床應用方面還有很長的路要走。

4 circRNAs與卒中

circRNAs是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型的內(nèi)源性ncRNAs，是RNA研究領域的一個熱點。與鏈端有5′帽和3′尾的線性RNA不同，環(huán)形RNA形成共價的閉環(huán)結(jié)構，既不具有5′-3′極性，也不含有多聚腺苷酸尾[21]。circRNAs是在研究植物類病毒和酵母線粒體RNA中發(fā)現(xiàn)的一種獨立類型的ncRNAs。當一個前體信使RNA分子的5′和3′端通過共價鍵連接在一起時，另一個亞組的ncRNAs就形成了環(huán)形結(jié)構，這樣的結(jié)構被命名為環(huán)形RNAs。它沒有明確意義上的5′帽端和3′多聚腺苷酸尾端，因此，環(huán)形RNA的性質(zhì)不穩(wěn)定，加之檢測技術的局限性，circRNAs的研究報道較少。根據(jù)它們的序列和起源，circRNAs可以分為循環(huán)內(nèi)含子、保留內(nèi)含子和外顯子3種類型[22]。circRNAs具有miRNAs結(jié)合元件與蛋白質(zhì)結(jié)合位點。當circRNAs與靶蛋白結(jié)合時，蛋白質(zhì)的功能將會受到抑制。被釋放到細胞質(zhì)中，甚至在細胞外釋放的circRNAs具有作為生物標志物的潛力。然而，少部分留在細胞核中的更小的circRNAs可以與宿主基因啟動子區(qū)的RNA聚合酶Ⅱ反應并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[23]。

據(jù)報道，circRNAs在諸多病理生理過程中也有重要作用，包括熱衰老、阿爾茨海默病、心肌肥厚和心力衰竭等[24]。然而，其在腦損傷和腦卒中修復中的作用報道很少。Bazan等[25]在臨床研究中指出，急性頸動脈相關缺血性卒中的患者血清中某些circRNAs如circR-284與miR-221含量升高，提示circRNAs可能作為診斷頸動脈相關腦缺血的潛在生物標志物。另外生物信息學分析發(fā)現(xiàn)卒中后一些circRNAs如circ-016423、circ-008018、circ-006696等會發(fā)生改變，含有大量miRNAs結(jié)合位點，此外，由這些circRNAs控制的主要生物學和分子功能包括代謝加工、細胞通訊、生物調(diào)節(jié)以及與蛋白質(zhì)、離子和核酸的結(jié)合在短暫性腦缺血之后都被改變[26]。綜上所述，這些結(jié)果表明，circRNAs在生物學發(fā)展和疾病的發(fā)生和演變過程中具有特殊的調(diào)節(jié)作用，有望成為新的臨床診斷和預后標志物，并為疾病的治療提供新的方向。

總之，circRNAs的功能與相關機制可能是多種多樣的。circRNAs可能會影響病理生理過程，作為疾病的診斷或預測生物標志物，也可能提供新的潛在治療靶點。然而，與miRNAs和lncRNAs相比，我們目前對circRNAs的了解較少。探究circRNAs的作用及功能，可能在疾病的診斷和治療中有巨大的應用潛力。近年來的研究主要集中在circRNAs的生物機制上，而在各種疾病的發(fā)展中，circRNAs的分子生物學機制尚未完全了解。隨著技術和研究的發(fā)展，將會發(fā)現(xiàn)其他的circRNAs序列。此外，進一步的研究將揭露出更多的circRNAs在疾病生理和病理過程中的作用。

5 挑戰(zhàn)與展望

目前磁共振成像技術仍然是卒中診斷的主要方法，雖然卒中患者血清/血漿中幾種蛋白標志物會變化，但卒中缺血損傷的特異性標志物尚未建立。且對ncRNAs作為缺血性腦卒中生物標志物的研究相對較少。其次，大多數(shù)miRNAs和lncRNAs被細胞內(nèi)循環(huán)/內(nèi)吞噬中豐富的核糖核酸酶迅速降解，因此作為腦卒中患者診斷或預后的生物標志物還有待研究。另一方面，與miRNAs和lncRNAs相比，circRNAs的半衰期相對較長，它更能成為腦卒中診斷和預后的的理想候選標志物。研究表明ncRNAs參與缺血性損傷，ncRNAs的調(diào)控作用可能是繼tPA后對卒中治療的有促進作用的方法，因此快速和可靠的ncRNAs檢測可能對卒中的早期診斷以及患者的卒中預后的預測有用。對實驗性卒中模型ncRNAs的調(diào)控機制的研究將有助于更好地理解ncRNAs在卒中中的作用?？傊?，ncRNAs的研究還存在很大的發(fā)展空間，可以確定的是ncRNAs對卒中的治療是有促進作用，其在細胞存活和神經(jīng)保護方面的治療效用還需要做大量的探究。

盡管面臨挑戰(zhàn)，但以ncRNAs為基礎的治療卒中的策略是很有前景的。為了更好地了解ncRNAs是如何通過數(shù)百個靶點發(fā)揮作用，還需更多的研究開發(fā)新的方法來識別候選ncRNAs標志物，設計化學或修飾制劑以更好地遞送ncRNAs，并不斷優(yōu)化減少不良反應。基于ncRNAs的臨床試驗和有效的藥物研究肯定會促進卒中治療領域的發(fā)展。隨著生物學信息的進步，更多關于ncRNAs的研究得以開展，確定其潛在的機制也是迫切需要的。隨著我們對卒中發(fā)病機制中ncRNAs表達和功能的認識，有希望能識別出新的卒中診斷生物標志物和有靶向治療意義的ncRNAs，隨著ncRNAs相關療效和準確性的不斷研究，卒中患者也可能從中受益。