釉原蛋白在牙周組織再生中的生物學(xué)作用

楊宇軒 張海霞 王爽

西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科 西安 710004

牙周炎是發(fā)生在牙周組織，在牙石等多種局部因素刺激下，以牙齦炎癥、牙槽骨吸收、牙周袋形成、牙齒松動為主要表現(xiàn)的一類疾病，其牙槽骨破壞呈現(xiàn)不可逆性[1]。臨床上對于牙槽骨吸收的主要治療方式有引導(dǎo)組織再生術(shù)（guided tissue regeneration，GTR）、牙周植骨術(shù)、生長因子治療等[2]。傳統(tǒng)的治療牙槽骨缺損的方法存在費用高、干細(xì)胞來源缺乏以及干細(xì)胞移植的倫理問題[3]、遠(yuǎn)期效果不確定[4]等限制，臨床治療效果并不理想。目前研究表明，釉基質(zhì)蛋白具有在牙周缺損區(qū)誘導(dǎo)形成與牙本質(zhì)緊密結(jié)合的無細(xì)胞牙骨質(zhì)、恢復(fù)牙周纖維附著、促進牙周再生的作用[5]，是現(xiàn)有治療手段的有效補充，但是其具體促進牙周再生的機制仍待研究。

牙周組織的再生涉及細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)行為，在這些過程中，釉原蛋白均起到一定的調(diào)節(jié)作用。因組織來源和細(xì)胞種類不同，釉原蛋白的調(diào)節(jié)作用也不盡相同，這些調(diào)控作用可以有效調(diào)控牙周組織缺損時優(yōu)先附著和增殖的細(xì)胞，具有重要的臨床意義。

1 對細(xì)胞遷移的調(diào)控

1.1 牙周膜成纖維細(xì)胞

牙周膜成纖維細(xì)胞（periodontal ligament fi-broblasts）是人牙周膜中數(shù)量最多、具有重要功能的一種細(xì)胞，具有獨特且高效的合成細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白的能力，是形成牙周膜纖維的主要細(xì)胞[6]。牙周膜成纖維細(xì)胞可以分化成為成骨細(xì)胞樣和成牙骨質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，并且被認(rèn)為在維持和修復(fù)牙周組織中起到重要作用[7]。

重組豬釉原蛋白（recombinant porcine amelogenin）作用于原代培養(yǎng)的牙周膜成纖維細(xì)胞，可以明顯促進牙周膜成纖維細(xì)胞的遷移。在無血清培養(yǎng)基中，添加重組豬釉原蛋白，培養(yǎng)牙周膜成纖維細(xì)胞，在細(xì)胞貼壁生長后，使用毛細(xì)管尖端在細(xì)胞匯合處制造無細(xì)胞劃痕，隨后48 h內(nèi)每12 h觀察細(xì)胞遷移情況，結(jié)果顯示與對照組相比，牙周膜成纖維細(xì)胞的遷移速率顯著增加[8]。還有實驗[9]表明，在釉原蛋白作用下，牙周膜成纖維細(xì)胞通過boyden小室的速率較對照組顯著提高，顯示釉原蛋白對牙周膜成纖維細(xì)胞遷移具有促進作用。

1.2 牙齦上皮細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞

牙齦是牙周組織的另一組成成分，其主要由牙齦上皮細(xì)胞（gingival epithelial cell）組成。由于牙齦上皮細(xì)胞生長迅速，在牙周組織受損后會搶先遷移至受損的牙槽骨表面，形成上皮附著，阻礙牙周組織的再生[10]。

重組豬釉原蛋白處理后的牙齦上皮細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，使用毛細(xì)管尖端在細(xì)胞匯合處制造無細(xì)胞劃痕，結(jié)果顯示，與對照組相比，24 h后牙齦上皮細(xì)胞的遷移速率出現(xiàn)了明顯下降[8]。同時，在重組豬釉原蛋白干預(yù)下，6 h后牙齦成纖維細(xì)胞的遷移速率也出現(xiàn)明顯下降。

1.3 牙周膜干細(xì)胞

牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cell）是存在于牙周膜中的一種未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有自我更新及多向分化潛能，在一定條件下能夠定向分化為成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。在免疫缺陷小鼠體內(nèi)，牙周膜干細(xì)胞可以產(chǎn)生牙骨質(zhì)、牙周膜樣結(jié)構(gòu)，是維持牙周組織穩(wěn)態(tài)，促進牙周組織再生的重要種子細(xì)胞[11]。

釉原蛋白可以促進干細(xì)胞遷移。在劃痕實驗中，實驗組以人全長重組釉原蛋白GST-rMI80處理體外培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞，并在12和24 h觀察其遷移情況。實驗[12]結(jié)果顯示，GST-rMI80處理的牙周膜干細(xì)胞的遷移速率顯著高于對照組。

1.4 可能的機制

研究[13]顯示，細(xì)胞膜表面蛋白Grp78可能是釉原蛋白的受體，其可以促使釉原蛋白進入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其促進細(xì)胞遷移作用。Toyoda等[12]研究發(fā)現(xiàn)，釉原蛋白可以與細(xì)胞膜表面葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白Grp78特異性結(jié)合，激光共聚焦顯微鏡顯示，這種聯(lián)結(jié)蛋白會誘導(dǎo)細(xì)胞的內(nèi)吞作用，沉默Grp78基因可以抑制其內(nèi)吞作用（圖1）。

圖1 Grp78介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用Fig 1 Grp78 mediated endocytosis

進一步研究顯示，釉原蛋白可以調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移相關(guān)基因的表達(dá)。在受到釉原蛋白作用時，Grp78過表達(dá)的細(xì)胞的遷移作用會顯著增強，同時不影響其對于細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用。沉默Grp78基因會消除釉原蛋白對細(xì)胞遷移的促進作用。

2 對細(xì)胞增殖的調(diào)控

2.1 牙周膜成纖維細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞

一項系統(tǒng)回顧[14]顯示，釉原蛋白干預(yù)的牙周膜成纖維細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞的增殖速率較對照組明顯增加，細(xì)胞內(nèi)DNA合成明顯增強，并且促進作用具有濃度依賴性。另有研究[8]以重組豬釉原蛋白處理牙周膜成纖維細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后進行細(xì)胞計數(shù)，實驗結(jié)果顯示，重組豬釉原蛋白可以顯著促進牙周膜成纖維細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞的增殖，其促進效果在重組豬釉原蛋白濃度為10 μg·mL-1時具有時間依賴性。

2.2 牙齦上皮細(xì)胞

使用重組豬釉原蛋白處理實驗組牙齦上皮細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，與成纖維細(xì)胞相反，重組豬釉原蛋白顯著抑制了牙齦上皮細(xì)胞的增殖[8]。

2.3 牙周膜干細(xì)胞

Kémoun等[15]研究發(fā)現(xiàn)，釉原蛋白可以顯著促進牙周膜干細(xì)胞增殖。Cheng等[16]使用人全長重組釉原蛋白和豬釉基質(zhì)蛋白處理牙周膜干細(xì)胞，在隨后8 d內(nèi)對細(xì)胞進行計數(shù)。實驗結(jié)果顯示，人全長重組釉原蛋白和豬釉基質(zhì)蛋白在干預(yù)后前3 d均能夠顯著增強牙周膜干細(xì)胞的增殖，在實驗觀察的8 d中，其促進增殖的效果始終存在，并在第6 d達(dá)到最高值。

2.4 可能的機制

有研究[17]顯示，釉原蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路密切相關(guān)。MAPK是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK/ERK通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，能夠?qū)⒓?xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞以及細(xì)胞核內(nèi)，引起多種生物學(xué)作用[18]。研究[19]表明，重組全長人釉原蛋白作用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時，可以顯著增強人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，MAPK通路阻滯劑U0126可以顯著抑制其促進增殖的作用。Yoshimi等[17]研究顯示，重組釉原蛋白作用下的人成牙骨質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化顯著增強，MARK抑制劑可以阻斷這一反應(yīng)。

3 對細(xì)胞黏附的調(diào)控

3.1 牙周膜成纖維細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞

釉原蛋白可以促進牙周膜成纖維細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞的細(xì)胞黏附作用。有研究[8]使用重組豬釉原蛋白處理牙周膜成纖維細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞，對黏附細(xì)胞用胰酶消化后進行細(xì)胞計數(shù)，結(jié)果顯示，重組豬釉原蛋白在牙周膜成纖維細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞生長的前30 min可以顯著促進細(xì)胞黏附；但隨著時間的延長，這種對細(xì)胞黏附的促進作用會逐漸下降，在干預(yù)4 h后，重組豬釉原蛋白對細(xì)胞黏附的促進作用幾乎消失。

3.2 牙齦上皮細(xì)胞

有研究[8]顯示，重組豬釉原蛋白能夠顯著抑制牙齦上皮細(xì)胞的黏附。另有研究[20]指出，釉原蛋白對牙齦上皮細(xì)胞黏附的抑制作用具有濃度和時間依賴性，釉原蛋白濃度越高，作用時間越長，對牙齦上皮細(xì)胞黏附的抑制作用越強。

3.3 牙周膜干細(xì)胞

釉原蛋白在一定時間內(nèi)可以促進牙周膜干細(xì)胞的細(xì)胞黏附。使用重組人全長釉原蛋白和豬釉原蛋白分別處理牙周膜干細(xì)胞，隨后對黏附細(xì)胞進行計數(shù)，實驗結(jié)果顯示接種2 h后，牙周膜干細(xì)胞的黏附率達(dá)到80%左右；重組人全長釉原蛋白和豬釉原蛋白均能夠在細(xì)胞接種的前60 min顯著提高牙周膜干細(xì)胞的黏附率，但在60 min之后對細(xì)胞黏附的影響與對照組沒有顯著性差異[16]。

3.4 可能的機制

目前對于釉原蛋白對細(xì)胞黏附影響的機制了解較少。Toyoda等[12]發(fā)現(xiàn)，沉默Grp78基因后，釉原蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞黏附也隨之消失，并認(rèn)為Grp78在釉原蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞黏附方面具有重要作用。

4 對細(xì)胞分化的調(diào)控

釉原蛋白在具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、黏附、增殖作用的同時，還顯示出具有誘導(dǎo)牙周組織細(xì)胞成骨分化的作用。在釉原蛋白的誘導(dǎo)下，成牙骨質(zhì)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞等都會表達(dá)成骨相關(guān)蛋白質(zhì)，并產(chǎn)生鈣化結(jié)節(jié)，對牙周組織再生具有重要意義。

4.1 間充質(zhì)干細(xì)胞

牙周組織的牙周膜干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均屬于間充質(zhì)干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)中，釉原蛋白可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生鈣化結(jié)節(jié)，并分化成為成骨細(xì)胞，這是牙周組織再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究[21]顯示，在含有重組釉原蛋白片段的培養(yǎng)液中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，其堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）的表達(dá)水平顯著上升。同時，在成骨環(huán)境中，重組釉原蛋白還可以增強堿性磷酸酶的活性，其最大濃度和最大活性都顯著高于對照組。

在成骨環(huán)境中，重組釉原蛋白片段還可以促進Ⅰ型原骨膠原和骨鈣蛋白的表達(dá)。實驗[22]結(jié)果顯示，在含有重組釉原蛋白片段的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，其第7和14 d的Ⅰ型原骨膠原和骨鈣蛋白的表達(dá)量都顯著高于對照組。

釉原蛋白對間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化誘導(dǎo)作用具有濃度依賴性。在誘導(dǎo)牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗[23]中，100 μg·mL-1的釉原蛋白在成骨誘導(dǎo)后1～2周就可以檢測到染色的鈣化結(jié)節(jié)；而25 μg·mL-1的釉原蛋白誘導(dǎo)時，則至少需要3～4周才可觀察到。在25和100 μg·mL-1釉原蛋白干預(yù)的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞中，堿性磷酸酶mRNA的表達(dá)量都明顯提高。

綜上，不同生物來源的釉原蛋白均具有促進間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的能力，并且這種促進能力具有濃度依賴性。

4.2 成牙骨質(zhì)細(xì)胞

成牙骨質(zhì)細(xì)胞是牙骨質(zhì)細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)一類可以分泌鈣化基質(zhì)和膠原纖維的細(xì)胞，其與牙根表面平行，是連接牙周膜和牙骨質(zhì)的組成部分。茜素紅染色顯示，釉原蛋白可以顯著增加成牙骨質(zhì)細(xì)胞分泌的鈣化基質(zhì)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)顯示，在釉原蛋白作用下，成牙骨質(zhì)細(xì)胞中的堿性磷酸酶、骨涎蛋白、骨鈣蛋白的表達(dá)明顯增加，具有促進成牙骨質(zhì)細(xì)胞成骨分化的作用[24]。

4.3 牙周膜干細(xì)胞

釉原蛋白可以顯著增加牙周膜干細(xì)胞的堿性磷酸酶表達(dá)量，并具有濃度依賴性。加入釉原蛋白抗體可以有效地抑制這種促進作用。加入抗體后，牙周膜干細(xì)胞的堿性磷酸酶表達(dá)量與對照組沒有顯著性差異。實驗[25]結(jié)果顯示，釉原蛋白可以促進牙周膜干細(xì)胞發(fā)生成骨分化。

4.4 可能機制

Olivares-Navarrete等[21]研究顯示，釉原蛋白作用于人間充質(zhì)干細(xì)胞，在使其發(fā)生成骨分化的過程中，蛋白激酶C、ERK1/2、β-連環(huán)蛋白發(fā)生了高度磷酸化；進一步研究顯示，ERK1/2的抑制劑可以阻斷細(xì)胞合成堿性磷酸酶、骨鈣蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2等成骨相關(guān)蛋白質(zhì)。因此，釉原蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞分化作用與ERK通路、蛋白激酶C和β-連環(huán)蛋白的降解密切相關(guān)（圖2）。

圖2 Wnt/β-連環(huán)蛋白通路示意圖Fig 2 Wnt/β-catenin pathway

重組釉原蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生成骨分化的過程與Wnt/β-連環(huán)蛋白通路密切相關(guān)。Wnt/β-連環(huán)蛋白通路在胚胎發(fā)育和成熟機體中均具有重要意義，同時還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，對維持同型細(xì)胞的黏附、防止細(xì)胞的移動發(fā)揮作用。

經(jīng)典的Wnt/β-連環(huán)蛋白通路作用方式是：Wnt分子與細(xì)胞膜表面特異性受體Frizzled結(jié)合，進而使β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的濃度升高。隨后β-連環(huán)蛋白向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，引起細(xì)胞的增殖、分化、成熟[26]。有研究[27]表明，在釉原蛋白處理的胚胎干細(xì)胞中，β-連環(huán)蛋白的表達(dá)量顯著上升，Wnt的細(xì)胞膜表面受體的表達(dá)量也明顯上調(diào)。同時，應(yīng)用特異性Wnt抑制劑sFRP-1可完全阻斷釉原蛋白介導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞成骨分化作用。

5 問題與展望

以往的研究證實，釉基質(zhì)蛋白可以誘導(dǎo)牙周組織的再生。釉原蛋白是釉基質(zhì)蛋白的主要組成成分，占釉基質(zhì)蛋白的90%以上，是釉基質(zhì)蛋白發(fā)揮牙周再生作用的主要成分[5]。在牙周組織再生過程中，釉原蛋白在細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附、細(xì)胞分化等過程中發(fā)揮著不同的生物學(xué)作用。通過基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，釉原蛋白作用過程中表達(dá)發(fā)生變化的基因涵蓋信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答、囊泡運輸、溶酶體活動，以及細(xì)胞骨架、細(xì)胞黏附和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)等方面[28]。同時，由于牙周組織的復(fù)雜性，在牙周組織發(fā)生缺損時，搶先黏附于缺損骨組織表面的細(xì)胞可以決定牙周組織愈合的性質(zhì)[10]，所以調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和黏附在牙周組織缺損的重建中具有重要的臨床意義。釉原蛋白的作用具有細(xì)胞特異性，可以抑制牙齦上皮細(xì)胞的遷移，促進間充質(zhì)干細(xì)胞、牙周膜成纖維細(xì)胞的遷移和增殖，從而有效促進骨組織和牙周膜的再生，誘導(dǎo)牙周缺損的重建，是理想的治療牙周組織缺損并促進牙周組織再生的藥物。

目前，對釉原蛋白的生物學(xué)作用研究較多，從不同細(xì)胞來源、不同種屬和不同作用方式等方面進行了闡述，同時在牙周組織之外的領(lǐng)域也得到了一定的臨床應(yīng)用[29]。目前認(rèn)為，在牙周組織再生過程中，釉原蛋白對葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白Grp78[12]、MAPK/ERK通路[19]和Wnt/β-連環(huán)蛋白通路[27]發(fā)揮著重要生物學(xué)作用。但是，已有的研究對于釉原蛋白在誘導(dǎo)牙周組織再生的過程中的具體作用方式仍不明確，還需要從以下幾個方面進一步探究釉原蛋白生物學(xué)效應(yīng)的機制。

1）釉原蛋白與效應(yīng)細(xì)胞的具體結(jié)合位點仍不明確，對如何激活信號通路、與細(xì)胞膜表面哪些受體結(jié)合而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)仍有待研究。

2）對不同通路之間是否存在潛在的聯(lián)系仍有待研究。

3）由于釉原蛋白是一種復(fù)合型蛋白質(zhì)，可被分為不同大小的片段，目前部分研究使用全長重組釉原蛋白，也有使用不同大小重組釉原蛋白片段進行的研究，尚沒有研究探討釉原蛋白能夠發(fā)揮最佳生物學(xué)效應(yīng)的最小片段的分子質(zhì)量。