家蠶肽聚糖識(shí)別蛋白的研究進(jìn)展

王　濤　陳奕君　史　楚　劉吉升

家蠶肽聚糖識(shí)別蛋白的研究進(jìn)展

王濤陳奕君史楚劉吉升

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院廣東廣州510006）

先天免疫是昆蟲(chóng)唯一的防護(hù)屏障，肽聚糖識(shí)別蛋白作為先天免疫中重要的免疫因子，在識(shí)別病原物，激活Toll通路和IMD通路，調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)體內(nèi)免疫應(yīng)答等反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用。肽聚糖識(shí)別蛋白在復(fù)雜的免疫反應(yīng)中擔(dān)任多種角色，文章從發(fā)現(xiàn)、分類、功能等多方面介紹了昆蟲(chóng)的肽聚糖識(shí)別蛋白，并且對(duì)家蠶體內(nèi)的12 種肽聚糖識(shí)別蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行了匯總，進(jìn)一步了解家蠶先天免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)制。

家蠶；先天免疫；病原相關(guān)分子模式；肽聚糖識(shí)別蛋白

免疫系統(tǒng)是生物進(jìn)化過(guò)程中形成的自我防御機(jī)制，包括先天性免疫（innate immune）和獲得性免疫（adaptive immunity）。昆蟲(chóng)沒(méi)有像其他高等動(dòng)物一樣進(jìn)化出獲得性免疫系統(tǒng)，因此主要依靠自身的先天性免疫系統(tǒng)抵御病毒、細(xì)菌、真菌等外源物的侵害[1]。昆蟲(chóng)的先天性免疫主要包括細(xì)胞免疫（cellular immunity）和體液免疫（humoral immunity）。細(xì)胞免疫是由免疫細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬，集結(jié)和包囊作用[2]，和高等動(dòng)物基本一致。而體液免疫則與高等動(dòng)物不同，他們不產(chǎn)生抗原-抗體反應(yīng)，而是以抗菌肽、溶菌酶、凝集素、蛋白抑制劑以及抗病毒因子等多種活性因子聯(lián)合血細(xì)胞建立一個(gè)開(kāi)放完整的免疫防御體系[3]。當(dāng)外源物進(jìn)入體腔后，昆蟲(chóng)通過(guò)體內(nèi)的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors, PRRs）識(shí)別外源物表面的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns, PAMPs），迅速產(chǎn)生一系列分子信號(hào)，激活Toll通路、IMD通路、JAK-STAT通路等先天免疫反應(yīng)中的重要通路，對(duì)抗病菌[4]。

1 病原相關(guān)分子模式

模式識(shí)別受體是先天性免疫反應(yīng)中一類保守的蛋白受體，是觸發(fā)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵，主要包括脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide binding proteins, LBPs）、肽聚糖識(shí)別蛋白（peptidoglycan recognition proteins, PGRPs）、β-1, 3-葡聚糖結(jié)合蛋白（β-1, 3-glucan binding proteins, βGRPs）等[5]。病原相關(guān)分子模式則是指病原物表面一種保守的分子模式，是一種無(wú)特定結(jié)構(gòu)的生物大分子，主要包括肽聚糖（peptidoglycan, PGN）、脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、葡聚糖（glucan）、脂磷壁酸（lipoteichoic acid）和甘露聚糖（glucomannan）等[6]。不同的病原相關(guān)分子模式能被不同的模式識(shí)別蛋白識(shí)別并結(jié)合，肽聚糖便是肽聚糖識(shí)別蛋白的靶標(biāo)[7]。有趣的是，根據(jù)構(gòu)成肽聚糖多肽鏈上的第三個(gè)氨基酸的不同，以及四肽尾之間連接方式的不同，肽聚糖又可分為L(zhǎng)-賴氨酸型（Lys-PGN），主要存在于革蘭氏陽(yáng)性菌，和二氨基庚二酸型（Dap-PGN），主要存在于革蘭氏陰性菌[8]。革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁最外層是肽聚糖（Lys-PGN），能被果蠅Drosophila melanogaster的肽聚糖識(shí)別蛋白識(shí)別，當(dāng)Lys-PGN入侵機(jī)體時(shí)，被胞外的肽聚糖識(shí)別蛋白識(shí)別并結(jié)合，在DmPGRP-SA, DmPGRP-SD和GNBP三種蛋白協(xié)同作用下，Spatzle前體蛋白被切割，形成可以與Toll受體蛋白結(jié)合的Spatzle蛋白二聚體，從而激活Toll免疫通路，傳遞免疫信號(hào)至細(xì)胞核，產(chǎn)生抗菌肽基因。而果蠅IMD通路則是被革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的Dap-PGN激活。兩種細(xì)菌對(duì)果蠅的免疫激活是不同的，分別啟動(dòng)不同的免疫通路[9]。

2 肽聚糖識(shí)別蛋白

先天免疫是昆蟲(chóng)唯一的防護(hù)屏障，肽聚糖識(shí)別蛋白作為先天免疫中重要的免疫因子，在識(shí)別病原物、激活Toll通路和IMD通路、調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)體內(nèi)免疫應(yīng)答等反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用。當(dāng)外界的細(xì)菌，真菌等微生物入侵機(jī)體時(shí)，被機(jī)體內(nèi)的肽聚糖識(shí)別蛋白識(shí)別：（1）激活細(xì)胞免疫反應(yīng)，由血細(xì)胞調(diào)控，將入侵的外源病原物殺死；（2）將此識(shí)別信號(hào)逐級(jí)傳遞放大，激活體液免疫通路，產(chǎn)生效應(yīng)物，從而抵御入侵的外源病原物[10]。肽聚糖識(shí)別蛋白家族的成員在這一復(fù)雜的響應(yīng)過(guò)程中擔(dān)任多種角色，主要包括：（1）能結(jié)合病原物表面的肽聚糖的識(shí)別受體功能；（2）能調(diào)控抗菌肽合成，細(xì)胞吞噬等作用的調(diào)節(jié)子功能；（3）具有裂解肽聚糖的酰胺酶活性和凝集作用的效應(yīng)因子功能[8]。

1996年Yoshida等人在家蠶Bombyxmori的血淋巴中發(fā)現(xiàn)并提取了一個(gè)能特異性結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁上的肽聚糖的蛋白，后被鑒定為BmPGRP-S1，對(duì)肽聚糖有較高的結(jié)合活性，且能激活酚氧化酶原系統(tǒng)（prophenoloxidase activating system）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，表明此蛋白參與了免疫反應(yīng)，這是昆蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)肽聚糖識(shí)別蛋白[11]。此后，又陸續(xù)在其他昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了約100 種肽聚糖識(shí)別蛋白。PGRPs是一段高度保守的氨基酸序列，都具有一個(gè)約165 個(gè)氨基酸大小的PGRP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與N-乙酰胞壁酸-丙氨酸酰胺酶和T7溶菌酶同源[12]。T7溶菌酶是一個(gè)Zn2+依賴性的水解酶，PGRPs具有Zn2+依賴性的5 個(gè)關(guān)鍵殘基（H-Y-H-T-C）時(shí)，也能像T7溶菌酶一樣打斷糖鏈上N-乙酰胞壁酸與L-丙氨酸之間的酰胺鍵裂解肽聚糖[12]。當(dāng)肽聚糖識(shí)別蛋白缺失一個(gè)或幾個(gè)殘基時(shí)，就不能裂解肽聚糖，不具有酰胺酶活性[12]。根據(jù)肽聚糖識(shí)別蛋白分子量的大小，又可將其分為長(zhǎng)型（L）和短型（Ｓ）。果蠅所編碼的17 個(gè)肽聚糖識(shí)別蛋白中，7 個(gè)為短型，含信號(hào)肽但不含有跨膜區(qū)，可能以分泌的形式存在。10 個(gè)為長(zhǎng)型，長(zhǎng)型當(dāng)中一部分含信號(hào)肽和跨膜區(qū)，可能以跨膜的形式存在，一部分不含信號(hào)肽和跨膜區(qū)，可能在胞內(nèi)行使功能。一般情況下長(zhǎng)型具有多種剪切形式，比短型復(fù)雜的多[13～14]。另外，岡比亞按蚊Anopheles gambiae中也發(fā)現(xiàn)了7種PGRPs，至少編碼9 種蛋白，4 種短型，5 種長(zhǎng)型。西方蜜蜂Apis mellifera中發(fā)現(xiàn)了1種長(zhǎng)型，1種短型。巴西白斑弄蝶Calpodes中發(fā)現(xiàn)了1 種短型。舌蠅Glossina morsitans中發(fā)現(xiàn)2 種長(zhǎng)型。大蠟螟Galleria mellonella中發(fā)現(xiàn)2 種。煙草天蛾Manduca sexta中發(fā)現(xiàn)2 種長(zhǎng)型。黃粉蟲(chóng)Tenebrio molitor中發(fā)現(xiàn)1 種長(zhǎng)型。人Homo sapiens和小鼠Mus musculus體內(nèi)發(fā)現(xiàn)4種PGRPs。家蠶作為鱗翅目的模式生物，近幾年也展開(kāi)了對(duì)肽聚糖識(shí)別蛋白的研究。2008年Tanaka等人在家蠶體內(nèi)鑒定出12 種肽聚糖識(shí)別蛋白，6 種長(zhǎng)型，6 種短型[15]。

3 家蠶肽聚糖識(shí)別蛋白的功能研究

家蠶是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，也是第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的鱗翅目昆蟲(chóng)，是鱗翅目模式生物。到目前為止，已經(jīng)對(duì)家蠶12 種肽聚糖識(shí)別識(shí)別蛋白進(jìn)行了初步分析。6 個(gè)短型的肽聚糖識(shí)別蛋白不含跨膜區(qū)，但都含有信號(hào)肽，為分泌型蛋白。6 個(gè)長(zhǎng)型的肽聚糖識(shí)別蛋白較為復(fù)雜，可能存在多種剪切形式。2010年許平震等對(duì)家蠶體內(nèi)的部分（10 種）肽聚糖識(shí)別蛋白的基因做了分析和表達(dá)譜[16]。5 種短型分別是BmPGRP-S1, BmPGRP-S2, BmPGRP-S3, BmPGRP-S4, BmPGRP-S5。5 種長(zhǎng)型分別是BmPGRP-L1, BmPGRP-L2, BmPGRP-L3, BmPGRP-L4, BmPGRP-L5。5 個(gè)長(zhǎng)型PGRPs分布于1 號(hào)染色體，5 個(gè)短型PGRPs當(dāng)中，BmPGRP-S1, BmPGRP-S2分布于9號(hào)染色體，BmPGRP-S3, BmPGRP-S5分布于16 號(hào)染色體?；蛐酒瑪?shù)據(jù)顯示BmPGRP-L5基因在5齡第3天的幼蟲(chóng)的各個(gè)組織中無(wú)表達(dá)，其余9 個(gè)PGRPs均為多組織表達(dá)。

12 個(gè)肽聚糖識(shí)別蛋白中BmPGRP-S1, BmPGRP-S2, BmPGRP-S3, BmPGRP-S4, BmPGRP-S5, BmPGRP-L1, BmPGRP-L6已有較深入的研究報(bào)道。1996年Yoshida等人對(duì)BmPGRP-S1的研究表明，BmPGRP-S1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的肽聚糖有很強(qiáng)的親和力，在沒(méi)有Ca2+存在的情況下，能與PGN結(jié)合，而不能與幾丁質(zhì)和β-1, 3-葡聚糖結(jié)合。在BmPGRP-S1缺失的情況下，肽聚糖無(wú)法激活酚氧化酶原系統(tǒng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，BmPGRP-S1可能參與家蠶體內(nèi)酚氧化酶原系統(tǒng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活[11]。這些功能特征在家蠶其他的肽聚糖識(shí)別蛋白中普遍存在。BmPGRP-S4和BmPGRP-S5也能激活酚氧化酶原系統(tǒng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17～19]。關(guān)于酰胺酶活性的研究表明，BmPGRP-S4和BmPGRP-S5都具有酰胺酶活性和抗菌活性，能引起細(xì)菌發(fā)生凝集反應(yīng)[17～19]。BmPGRP-L6和BmPGRP-L1作為長(zhǎng)型的肽聚糖識(shí)別蛋白，都因缺乏酰胺酶活性的幾個(gè)關(guān)鍵性殘基而不具有酰胺酶活性[20～21]。關(guān)于肽聚糖結(jié)合試驗(yàn)的結(jié)果表明，BmPGRP-S4主要結(jié)合Dap-PGN[19]，BmPGRP-S5對(duì)Lys-PGN有較強(qiáng)的結(jié)合力，對(duì)Dap-PGN的結(jié)合能力較弱[18]，BmPGRP-L1和BmPGRP-L6都可以結(jié)合兩種類型的肽聚糖[20～21]。通過(guò)外源物感染發(fā)現(xiàn)，BmPGRP-S2基因能被革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[22]。感染家蠶質(zhì)多角體病毒（Cytoplasmic Polyhedrosis Virus, CPV）后，BmPGRP-S3基因相對(duì)表達(dá)水平顯著上調(diào)[22]。感染革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌后，BmPGRP-S4基因在中腸中強(qiáng)烈誘導(dǎo)，BmPGRP-S5基因在脂肪體和中腸中顯著上調(diào)[17～19]。根據(jù)RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)，RNA敲除BmPGRP-S2基因后，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子Relish, Attacin, Gloverin和Moricin等IMD通路下游的抗菌肽基因的下調(diào)表達(dá)，這表明BmPGRP-S2基因可能參與IMD信號(hào)通路[23]。BmPGRP-L6基因和BmPGRP-S5基因也做了RNA敲除實(shí)驗(yàn)，敲除BmPGRP-L6基因和BmPGRP-S5基因之后，再進(jìn)行微生物感染，被大腸桿菌感染后的抗菌肽基因出現(xiàn)了下調(diào)，這說(shuō)明，這兩個(gè)基因也與IMD途徑的激活有關(guān)系[20]。體內(nèi)阻斷BmPGRP-L1蛋白后，抗菌肽基因表達(dá)水平下降。S2細(xì)胞中BmPGRP-L1基因與BmIMD基因的過(guò)表達(dá)結(jié)果顯示，抗菌肽基因被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。免疫共沉淀反應(yīng)未能檢測(cè)到BmPGRP-L1基因與BmIMD基因之間存在相互作用關(guān)系[21]，而B(niǎo)mPGRP-S2, BmPGRP-S5, BmPGRP-L1, BmPGRP-L6均被指出與IMD途徑存在聯(lián)系，具體與IMD途徑存在何種聯(lián)系，肽聚糖識(shí)別蛋白之間是否存在互相作用的關(guān)系，還需進(jìn)一步探討。

4 小結(jié)

蠶絲業(yè)起源于中國(guó)，距今已有五千多年的歷史，從古代的“絲綢之路”到如今的“一帶一路”，都與蠶絲產(chǎn)業(yè)息息相關(guān)[24]。我國(guó)的蠶絲生產(chǎn)量占世界蠶絲生產(chǎn)總量的75 ％以上。而蠶病深受天氣條件的制約，發(fā)病率高，處理不及時(shí)和措施不得力的農(nóng)戶基本顆粒無(wú)收，損失慘重[25]。目前，傳染性蠶病尚無(wú)特效藥治療，以預(yù)防和滅菌為主。

近年來(lái)，通過(guò)模擬自然環(huán)境的微生物感染和一系列分子生物學(xué)技術(shù)手段分析了部分肽聚糖識(shí)別蛋白在家蠶免疫反應(yīng)中的作用，進(jìn)行了基因與蛋白的功能性研究，使我們對(duì)家蠶的免疫反應(yīng)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，但仍不夠深入。機(jī)體的免疫反應(yīng)是相輔相成，息息相關(guān)的。在果蠅中，激活Toll通路需要至少PGRP-SD, PGRP-SA和GNBP等三種蛋白協(xié)同作用，是一個(gè)復(fù)雜的免疫響應(yīng)過(guò)程[26]。果蠅PGRP-SC2能抑制IMD途徑的活化，卻能激活Toll通路[27]。在小菜蛾中的研究中表明，PxPGRP-LC可以單獨(dú)發(fā)揮作用，也可能作為其他PGRP受體的輔助受體發(fā)揮作用[28]。因此，還需對(duì)家蠶肽聚糖識(shí)別蛋白進(jìn)行更深入更系統(tǒng)的研究，有助于明確家蠶免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)制，對(duì)蠶病的防治有一定的意義，同時(shí)為鱗翅目其他物種在免疫方面的研究提供經(jīng)驗(yàn)。

[1]Lavine MD,Strand MR.Insect hemocytes and their role in immunity.Insect Biochem.Mol.Biol,2002,32(10):1295-1309.

[2]吳姍,凌爾軍.昆蟲(chóng)細(xì)胞免疫反應(yīng)中的吞噬?集結(jié)和包囊作用.昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2009,52(7):81-88.

[3]黃自然,陳勁偉.昆蟲(chóng)防御機(jī)制研究的一些進(jìn)展.生物學(xué)通報(bào),1990(10):9-10.

[4]Yu XQ.Pattern recognition proteins in Manducasexta plas ma.Insect Biochem Mol Biol,2002,32(10):1287-1293.

[5]Lemaitre B,Reichhart JM,Hoffmann JA.host defense:differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganisms.Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94(26):14614-14619.

[6]Fabrick JA,Baker JE,Kanost MR.cDNA cloning,purification,properties,and function of a β-1,3-glucan recognition protein from a pyralid moth,.Insect Biochem.Mol.Biol,2003,33(6):579-594.

[7]Wolf AJ,Underhill DM.Peptidoglycan recognition by the innate immune system.Nat.Rev.Immunol,2018.18(4):243-254.

[8]陳康康,呂志強(qiáng).昆蟲(chóng)肽聚糖識(shí)別蛋白研究進(jìn)展.昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2014.57(8):969-978.

[9]Valanne S,Wang JH,Ramet M.TheToll signaling pathway.J Immunol,2011,186(2):649-656.

[10]劉甜,羅開(kāi)珺.果蠅Toll和IMD信號(hào)通路中的功能結(jié)構(gòu)域.環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2011,33(3):388-395.

[11]Yoshida H,Kinoshita K,Ashida M.Purification of a pepti doglycan recognition protein from hemolymph of the silkworm,.J Biol Chem,1996,271(23):13854-13860.

[12]Dziarski R,Gupta D.he peptidoglycan recognition proteins (PGRPs).Genome Biol,2006,7(8):232.

[13]Lemaitre B,Hoffmann J.The host defense of.Annu Rev Immunol,2007,25(1):697-743.

[14]許平震.昆蟲(chóng)先天免疫的肽聚糖識(shí)別蛋白的研究進(jìn)展.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(23):82-84+88.

[15]Tanaka H.A genome-wide analysis of genes and gene families involved in innate immunity of.Insect Biochem Mol Biol,2008,38(12):1087-1110.

[16]許平震.家蠶模式識(shí)別受體PGRP?βGRP編碼基因的克隆鑒定及表達(dá)譜分析蠶業(yè)科學(xué),2010,36(3):14-21.

[17]Chen K.A short-type peptidoglycan recognition protein from the silkworm:expression,characterization and involvement in the prophenoloxidase activation pathway.Dev Comp I mmunol,2014.45(1):1-9.

[18]陳康康.家蠶中腸免疫轉(zhuǎn)錄組分析及家蠶肽聚糖識(shí)別蛋白-S5的功能研究.2016,西北農(nóng)林科技大學(xué).

[19]Yang PJ.Molecular cloning and characterization of a short peptidoglycan recognition protein from silkworm.Insect Mol Biol,2017.26(6):665-676.

[20]Tanaka H,Sagisaka A.Involvement of Peptidoglycan Recognition Protein L6 in Activation of Immune Deficiency Pathway in the Immune Responsive Silkworm Cells.Arch.Insect Biochem.Physiol,2016.92(2):143-156.

[21]Zhan MY,Yang PJ,Rao XJ.Molecular cloning and analys is of PGRP-L1 and IMD from silkworm.Comp.Biochem.Phys.B,2018.215:19-30.

[22]Gao K.Cloning and expression analysis of a peptidoglyc an recognition protein in silkworm related to virus infection.Gene,2014.552(1):24-31.

[23]Yang J.Peptidoglycan recognition protein S2 from silkworm integument:characterization,microbe-induced expression,and involvement in the immune-deficiency pathway.J Insect Sci,2015.15(1):20.

[24]李建琴,顧國(guó)達(dá).“一帶一路”對(duì)中國(guó)蠶絲業(yè)發(fā)展的戰(zhàn)略意義[J].中國(guó)蠶業(yè),2015,36(4):1-7.

[25]張晴,周振亞,羅其友.我國(guó)桑蠶業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對(duì)策[J].農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題,2008,000(001):18-21.

[26]Jang IH.A Spatzle-processing enzyme required for toll signaling activation in Drosophila innate immunity.Dev Cell,2006.10(1):45-55.

[27]Costechareyre D.Tissue-Specific Regulation of Drosophila NF-kappa B Pathway Activation by Peptidoglycan Reco gnition Protein SC.J Innate Immun,2016.8(1):67-80.

[28]Zhan MY,Yang PJ,Rao XJ.Cloning and analysis of pept idoglycan recognition protein-LC and immune deficiency from the diamondback moth,.Arch.Insect Biochem.Physiol,2018.97(2):e21436.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No：31501898），廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No：2017A030313152），廣州大學(xué)全日制研究生“基礎(chǔ)創(chuàng)新”項(xiàng)目（No：2017GDJC-M28，2018GDJC-M25）。

王濤（1994- ），女，漢族，河南安陽(yáng)人，碩士，研究方向：昆蟲(chóng)生理生化與分子生物學(xué)。

劉吉升，男，副教授。

S881.2

A

2095-1205(2019)11-16-03

10.3969/j.issn.2095-1205.2019.11.08