核糖體結(jié)合蛋白1干擾慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)人肝癌細(xì)胞的干擾效應(yīng)*

朱少美，劉集鴻，周 瀟

(惠州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東惠州 516001)

肝癌是全球惡性腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，具有高發(fā)病率、高病死率的特點(diǎn)，在男性中其發(fā)病率占第5位，病死率占第2位；在女性中其發(fā)病率占第9位，病死率占第6位[1]。我國(guó)是肝癌高發(fā)國(guó)家，肝癌發(fā)病人數(shù)占全球發(fā)病人數(shù)的55%，死亡人數(shù)僅次于肺癌，位居第2位[2]。在我國(guó)，引起肝癌發(fā)生的主要原因是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)[3]等病毒感染，病毒復(fù)制依賴宿主細(xì)胞，需與宿主蛋白，如核糖體結(jié)合蛋白1(RPN1)等相互作用。RPN1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)寡糖轉(zhuǎn)移酶的重要功能蛋白，協(xié)助初生蛋白進(jìn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并進(jìn)行糖基化修飾[4-5]。有研究報(bào)道表明，黃頭病毒、登革病毒等感染宿主細(xì)胞后，RPN1蛋白表達(dá)增強(qiáng)并促進(jìn)病毒感染[6-7]。因此，RPN1可能參與肝炎病毒引起的肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究將利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建針對(duì)RPN1基因的RNA干擾慢病毒，感染肝癌細(xì)胞系，建立RPN1低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株，旨在進(jìn)一步研究RPN1基因在肝炎病毒所致肝癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制，為其防治提供重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 293T細(xì)胞和Huh7.5.1細(xì)胞是南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院饋贈(zèng)，培養(yǎng)基為DMEM(Hyclone)和胎牛血清(上海微科生化試劑有限公司)。慢病毒載體系統(tǒng)：工具質(zhì)粒GV248、病毒包裝輔助質(zhì)粒(Helper 1.0)和病毒包裝輔助質(zhì)粒(Helper 2.0)均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供；引物序列合成與測(cè)序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成；限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ購自NEB公司；T4 DNA ligase購自Thermo Scientific公司；Taq Plus DNA polymerase購自南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒EndoFree midi Plasmid Kit購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2RNP1 RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建 針對(duì)RPN1(基因序列號(hào)NM_002950)序列，設(shè)計(jì)RNA干擾靶點(diǎn)：GAG GAA GAG AAC AAT TTG GAA，由此構(gòu)建干擾序列，合成單鏈引物RPN1 RNA干擾-a和-b，見表1。合成的單鏈引物干粉溶解后，90 ℃水浴15 min退火，自然冷卻至室溫，合成雙鏈DNA引物。慢病毒載體GV248經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ 37 ℃ 3 h雙酶切成線性。T4 DNA ligase將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈DNA連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α株，陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定。PCR鑒定引物序列，上游引物5′-CCA TGA TTC CTT CAT ATT TGC-′3，下游引物5′-ATG TCC TTC TGC TGA TAC TGG G-′3。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)22次；72 ℃ 5 min，最后冷卻至4 ℃。PCR鑒定陽性的克隆接種于含氨芐抗菌藥物的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，取適量菌液送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，比對(duì)正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取。

表1 RPN1 RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建框架序列

1.3RNA干擾慢病毒包裝與濃縮 將鑒定正確的RPN1 RNA干擾慢病毒質(zhì)粒20 μg與病毒包裝輔助質(zhì)粒(Helper 1.0)15 μg、病毒包裝輔助質(zhì)粒(Helper 2.0)10 μg用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，轉(zhuǎn)染6 h后換10%血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)和綠色熒光蛋白表達(dá)，收集293T細(xì)胞上清液。將上清液于4 ℃、4 000 g 離心10 min，用0.45 μm濾器過濾，用Beckman超速離心機(jī) 于4 ℃、25 000 r/min離心2 h，離心后，棄去上清，盡量去除殘留在管壁上的液體，加入病毒保存液重懸，-80 ℃保存。

1.4梯度稀釋法測(cè)定病毒濃度 將293T細(xì)胞鋪板按4×104細(xì)胞/孔鋪于96孔板。次日，將待測(cè)病毒取10 μL，加入90 μL無血清培養(yǎng)基，記為1E+1 μL，分別逐級(jí)10倍梯度稀釋至1E-6 μL。將細(xì)胞原培養(yǎng)基棄掉，加入病毒液，4 d后，觀察熒光表達(dá)情況并計(jì)算出現(xiàn)熒光但數(shù)量最少的孔中熒光細(xì)胞數(shù)，病毒滴度=熒光細(xì)胞數(shù)/病毒原液量，單位為TU/mL。

1.5RPN1 RNA干擾慢病毒在肝癌細(xì)胞的表達(dá) 在37 ℃、5%CO2條件下，肝癌細(xì)胞系Huh7.5.1培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將2×105/孔接種于6孔板中。實(shí)驗(yàn)按10 MOI加入病毒進(jìn)行感染，分為兩組：RPN1 RNA干擾慢病毒組和陰性對(duì)照組(NC，插入非相關(guān)序列的慢病毒，陰性對(duì)照插入序列為TTC TCC GAA CGT GTC ACG T)，感染后16 h換成完全培養(yǎng)基，72 h后用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定病毒干擾效果 Trizol提取細(xì)胞RNA，通過RT-qPCR方法測(cè)定RPN1的表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參基因，逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR檢測(cè)分別使用Promega的M-MLV試劑盒和TAKARA的SYBR Master Mixture試劑盒嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。引物序列：RPN1上游引物5′-GGA CCT ACT GGA TTA TGG G-′3，下游引物5′-GAT GGT CTT AAA AGA ACG GA-′3；GAPDH上游引物5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-′3，下游引物5′-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-′3。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。結(jié)果采用ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié) 果

2.1RPN1 RNA干擾慢病毒載體的鑒定 RPN1 RNA干擾雙鏈DNA引物與酶切線性化的慢病毒載體GV248連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆進(jìn)行PCR鑒定，見圖1。將PCR鑒定正確的陽性克隆培養(yǎng)后，取菌液測(cè)序，結(jié)果正確。

注：孔道1為陰性對(duì)照(ddH2O)；孔道2為陰性對(duì)照(空載體)；孔道3為Marker，自上而下依次為5.0 kb、3.0 kb、2.0 kb、1.5 kb、1.0 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；孔道4～8為RPN1 RNA干擾轉(zhuǎn)化子。連接入RPN1 RNA干擾片段的陽性克隆PCR片段大小為534 bp，沒有連接入RPN1 RNA干擾片段的空載體克隆PCR片段大小為500 bp

圖1 RPN1 RNA干擾慢病毒載體PCR鑒定

2.2RPN1 RNA干擾慢病毒的包裝及滴度測(cè)定 RPN1 RNA干擾慢病毒感染293T細(xì)胞48 h后可觀察到明顯綠色熒光蛋白，收集病毒上清并濃縮，用梯度稀釋法測(cè)定病毒滴度為2×109TU/mL。病毒包裝成功。

2.3RPN1 RNA干擾慢病毒在Huh7.5.1細(xì)胞的表達(dá) Huh7.5.1細(xì)胞感染 RPN1 RNA干擾慢病毒72 h后可檢測(cè)到綠色熒光蛋白，綠色熒光陽性率達(dá)90.0%以上，表明該慢病毒可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)且表達(dá)率高。見圖2。

注：空白對(duì)照為未加慢病毒，naive Huh7.5.1細(xì)胞；陰性對(duì)照為加入了含對(duì)照序列的慢病毒的Huh7.5.1細(xì)胞； RPN1 RNA干擾慢病毒為加入了RPN1 RNA干擾慢病毒的Huh7.5.1細(xì)胞

圖2慢病毒感染Huh7.5.1細(xì)胞熒光圖

2.4RPN1 RNA干擾慢病毒的干擾效果 Huh7.5.1細(xì)胞感染 RPN1 RNA干擾慢病毒72 h后用RT-qPCR測(cè)定RPN1基因的干擾效果，見圖3，RPN1 RNA干擾慢病毒組RPN1 mRNA表達(dá)量為0.076±0.022，而對(duì)照組為1.007±0.006。相對(duì)于陰性對(duì)照，RPN1 RNA干擾慢病毒組RPN1基因表達(dá)明顯下降(t=69.788，P<0.05)，敲減效率達(dá)到92.4% ，表明成功干擾了RPN1基因的表達(dá)。

注：陰性對(duì)照為加入了含對(duì)照序列的慢病毒的Huh7.5.1細(xì)胞；RPN1 RNA干擾慢病毒為加入了RPN1 RNA干擾慢病毒的Huh7.5.1細(xì)胞

圖3 RPN1基因在Huh7.5.1的表達(dá)

3 討 論

RPN1是粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)寡糖轉(zhuǎn)移酶的一部分，橫穿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔內(nèi)的氨基末端和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的羧基端，協(xié)助待加工蛋白進(jìn)入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與核糖體結(jié)合、新生蛋白跨膜易位及進(jìn)一步修飾，有研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與肺癌、甲狀腺癌等發(fā)生相關(guān)[8-10]，相對(duì)于健康組織，癌癥組織的表達(dá)明顯升高，而其與肝癌的關(guān)系尚不明確。原發(fā)性肝癌中約90%屬于肝細(xì)胞癌，而其中約80%是HBV或HCV的攜帶者[11]。病毒感染引起機(jī)體免疫系統(tǒng)活躍，在病毒與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互抗?fàn)庍^程中不可避免帶來持續(xù)性的慢性肝損傷，這是肝炎病毒引起肝癌的主要原因[12]。研究肝炎病毒的復(fù)制對(duì)控制肝炎病毒引起的肝癌至關(guān)重要。病毒與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上功能蛋白相互作用，從而介導(dǎo)病毒的復(fù)制增殖[13]。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細(xì)胞中蛋白加工、折疊、糖基化修飾的主要場(chǎng)所，由于氧化應(yīng)激、病毒感染等病理因素，未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，容易誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)[14]，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮著十分重要的作用[15]。RPN1是粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)寡糖轉(zhuǎn)移酶最重要的功能蛋白，可以與肝炎病毒引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)相關(guān)，參與肝炎病毒的復(fù)制并導(dǎo)致肝癌的發(fā)生，而目前尚無任何文獻(xiàn)報(bào)道，其基因功能尚未清晰。

RNA干擾是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象，利用該現(xiàn)象建立了RNA干擾技術(shù)，該技術(shù)可以快速、特異、高效沉默特定的基因片段，是目前研究基因功能的有效手段[16-17]。RNA干擾效應(yīng)常用的有小干擾RNA(siRNA)和短發(fā)夾RNA(shRNA)。siRNA制備簡(jiǎn)單，其轉(zhuǎn)染具有瞬時(shí)性。而shRNA是具有兩個(gè)短的反向重復(fù)序列的RNA，具有高效性和可持續(xù)復(fù)制等優(yōu)勢(shì)，近年來更多應(yīng)用于基因沉默表達(dá)的相關(guān)研究中[18-19]。質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)率低，不能持續(xù)性表達(dá)，而慢病毒或者腺病毒感染具有操作容易、感染效率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)，尤其在腫瘤細(xì)胞等惰性細(xì)胞中仍具有較高的轉(zhuǎn)染率[20]，在RNA干擾技術(shù)中越來越受到重視。針對(duì)靶基因，設(shè)計(jì)shRNA慢病毒載體，包裝病毒進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，是目前RNA干擾的常用策略。本研究為了探索RPN1與肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，選用的是目前體外廣泛應(yīng)用的肝癌細(xì)胞系Huh7.5.1，通過構(gòu)建針對(duì)RPN1基因的shRNA載體，構(gòu)建干擾慢病毒，在該細(xì)胞下調(diào)該基因的表達(dá)，為該基因的研究提供很好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究中，針對(duì)RPN1的shRNA質(zhì)粒易于構(gòu)建，PCR結(jié)果鑒定顯示構(gòu)建成功。并通過輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)成功在293T細(xì)胞上進(jìn)行病毒包裝，濃縮的病毒滴度高達(dá)109TU/mL以上，高于文獻(xiàn)報(bào)道的其他慢病毒載體的感染病毒滴度[21-22]，表明該慢病毒感染系統(tǒng)包裝效率高。同時(shí)該構(gòu)建的慢病毒感染肝癌細(xì)胞的陽性率高達(dá)90.0%以上，熒光定量檢測(cè)RPN1表達(dá)量發(fā)現(xiàn)其敲減效率達(dá)到92.4%，敲減效果明顯，表明選取的針對(duì)目的基因序列的干擾作用明顯，并且該慢病毒干擾體系十分有效。

4 結(jié) 論

綜上所述，應(yīng)對(duì)RPN1可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，但尚未明確這一研究現(xiàn)狀，本研究構(gòu)建針對(duì)RPN1基因的shRNA感染慢病毒載體，利用輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)成功包裝高滴度的干擾慢病毒，感染人肝癌細(xì)胞系Huh7.5.1并確定了其干擾效應(yīng)，建立了RPN1低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株，將為進(jìn)一步研究RPN1基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中分子機(jī)制的研究奠定重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。