α-硫辛酸抗氧化作用機制及其在動物生殖細(xì)胞和早期胚胎中抗氧化作用的研究進(jìn)展

黃自強，龐云渭，郝海生，王彥平，朱化彬*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.北京奶牛中心，北京 100192）

人類體外受精（in vitroFertilization，IVF）在過去40年里取得了巨大進(jìn)步，但仍存在許多尚待解決的問題和需要優(yōu)化的程序[1]。影響IVF的因素較多，其中整個胚胎體外生產(chǎn)體系中的氧化應(yīng)激是重要影響因素之一。體內(nèi)生殖細(xì)胞和胚胎發(fā)育所處的氧氣濃度較低，一般為2%～8%，但體外培養(yǎng)環(huán)境中氧氣濃度較高，約為20%[2]。雖然體內(nèi)存在酶類和非酶類抗氧化劑，但高氧環(huán)境中的抗氧化系統(tǒng)不足以及時清除過量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），進(jìn)而對哺乳動物的生殖細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育造成不利影響。因此，現(xiàn)在普遍認(rèn)為ROS引起的氧化應(yīng)激是精子[3]、卵母細(xì)胞[4]和早期胚胎[5]發(fā)育能力下降或發(fā)生凋亡的主要原因之一。

高氧環(huán)境條件下，精液品質(zhì)降低、卵母細(xì)胞和早期胚胎的發(fā)育能力降低很可能是氧化應(yīng)激造成的。有研究表明，在培養(yǎng)液中添加不同種類的抗氧化劑或還原劑后，精子中脂質(zhì)過氧化和DNA損傷得到一定程度的緩解[6]，卵母細(xì)胞成熟及其形成的早期胚胎發(fā)育能力得到明顯改善[7]。α-硫辛酸（Alpha Lipoic Acid，LA）作為一種強抗氧化劑，不僅在預(yù)防和治療氧化應(yīng)激和自由基相關(guān)疾病（如糖尿病[8]、高血壓[9]等）中具有重要作用，在削弱氧化應(yīng)激造成的精子質(zhì)量下降[10]和促進(jìn)卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育能力[11]過程中也具有積極作用。因此，本文就LA發(fā)揮抗氧化作用的機制及其在動物生殖細(xì)胞和早期胚胎中發(fā)揮抗氧化作用進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步探明LA在生殖細(xì)胞中抗氧化作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路奠定理論基礎(chǔ)。

1 ROS對生殖細(xì)胞和早期胚胎的危害

ROS是有機體氧化還原反應(yīng)過程中O2轉(zhuǎn)化為H2O的中間代謝產(chǎn)物，主要包括O2.-、過氧化氫（H2O2）、羥自由基（.OH）和過氧化亞硝基（ONOO.）[12]。當(dāng)生物體暴露于不同來源的ROS時，其通過體內(nèi)存在的抗氧化劑進(jìn)行防御。雖然一定量的ROS是細(xì)胞發(fā)揮其正常功能所必需的，但ROS過度積累時會造成氧化應(yīng)激，從而使機體內(nèi)環(huán)境不利于正常的生理反應(yīng)。

少量ROS有利于正常的精-卵受精過程，但高水平ROS對精子獲能和頂體反應(yīng)等重要生理過程具有抑制作用[13]。當(dāng)ROS含量超過生理濃度時，ROS含量與精子活力呈負(fù)相關(guān)[14]。精子長期處于ROS過高環(huán)境中會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和DNA損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜流動性和功能的喪失，甚至產(chǎn)生突變效應(yīng)和細(xì)胞毒性作用，最終使精子失去活力[15]。此外，冷凍精液中的畸形精子、死亡精子和白細(xì)胞自身代謝產(chǎn)生大量ROS，冷凍精液解凍和離心過程也會產(chǎn)生過量ROS，不僅改變精子活力和形態(tài)并降低其受精能力[16-18]。

體外培養(yǎng)環(huán)境中較高氧氣濃度產(chǎn)生大量的ROS對卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育具有抑制作用。卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)體系中氧氣濃度、葡萄糖、金屬離子、紫外光照、血清等均能使卵母細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高[17]。卵母細(xì)胞中ROS產(chǎn)生的主要過氧化物來源包括黃嘌呤氧化酶和線粒體[19-20]。雖然線粒體是ATP和ROS產(chǎn)生的主要部位，但過量的ROS會影響卵母細(xì)胞線粒體的功能，使線粒體功能失調(diào)從而可能抑制細(xì)胞分裂[21]。Tripathi等[22]發(fā)現(xiàn)，印楝葉提取物能夠通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激造成卵丘細(xì)胞凋亡并降低雌激素水平和卵母細(xì)胞質(zhì)量。在小鼠卵母細(xì)胞中，高水平ROS能夠抑制減數(shù)細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。此外，ROS引發(fā)的氧化應(yīng)激還可誘導(dǎo)端?？s短、染色體變性紊亂、卵母細(xì)胞破碎和受精失敗[23]。

在早期胚胎發(fā)育所處的微環(huán)境中，ROS過量產(chǎn)生對早期胚胎發(fā)育具有抑制作用。大氣氧濃度下培養(yǎng)的豬和牛胚胎中ROS含量顯著升高[24-25]，從而造成細(xì)胞膜和DNA損傷，并導(dǎo)致胚胎發(fā)育產(chǎn)生缺陷和延遲[26]。此外，大氣中氧氣濃度產(chǎn)生過量ROS抑制早期胚胎中基因表達(dá)[27]，誘導(dǎo)胚胎DNA損傷[28]，改變囊胚中蛋白組[29]，干預(yù)胚胎發(fā)育各個階段中碳水化合物和氨基酸代謝[30-31]，使胚胎產(chǎn)生表觀遺傳學(xué)變化[32]。

過量的ROS會對動物生殖細(xì)胞和早期胚胎的結(jié)構(gòu)和功能造成一定損傷，因此，研究者通過在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中添加抗氧化劑來削弱ROS產(chǎn)生的氧化應(yīng)激對生殖細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育造成的影響。研究表明，褪黑素[7]、維生素C[33]、維生素E[34]、白藜蘆醇[35]、茶多酚[36]等在降低ROS對動物生殖細(xì)胞和早期胚胎的損傷中發(fā)揮著重要作用。

2 LA的化學(xué)性質(zhì)及其代謝

LA化學(xué)名稱為1，2-二硫戊烷-3-戊酸，分子式為C8H14O2S2，相對分子質(zhì)量為206.33。LA因其烷基鏈?zhǔn)怪哂幸欢ǖ闹苄?，羧基端極性使之具有良好的水溶性。因此，LA可以自由進(jìn)出細(xì)胞并在細(xì)胞的各個部位發(fā)揮作用，這是LA作為抗氧化劑優(yōu)于其他抗氧化劑的關(guān)鍵所在。如圖1所示，LA在體內(nèi)存在2種形式，即氧化型硫辛酸（LA）和還原型硫辛酸（DHLA），并且這2種形式的LA都具有抗氧化作用。

圖1 LA（A）和DHLA（B）結(jié)構(gòu)示意圖

LA通過pH依賴途徑穿過單層細(xì)胞膜，但苯甲酸和中鏈脂肪酸均能抑制其轉(zhuǎn)運，從而表明單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白是小腸吸收LA的載體[37]。Balamurugan等[38]研究發(fā)現(xiàn)，LA可作為胃腸道吸收過程中鈉依賴性維生素轉(zhuǎn)運蛋白的作用底物，有助于胃腸道吸收。近年來研究表明，鈉依賴性維生素轉(zhuǎn)運蛋白是在維生素和其他重要的輔因子（如LA和生物素）遷移過程中發(fā)揮重要作用的跨膜蛋白[39]。

3 LA抗氧化作用機制

3.1 直接清除ROS LA因其具有雙硫五元環(huán)的結(jié)構(gòu)而具有顯著的親電能力和與自由基反應(yīng)的能力。LA可以清除體內(nèi).OH、一氧化氮自由基（NO.）和ONOO.等自由基和過氧化氫、次氯酸等易于產(chǎn)生自由基的物質(zhì)，其還原產(chǎn)物DHLA可以對體內(nèi)常見的過氧化物自由基（ROO.）和O2.-發(fā)揮直接清除作用[40]。Ghibu等[41]發(fā)現(xiàn)，DHLA能夠降低超氧化物驅(qū)動的對敏感自旋探針的氧化，其作用方式與超氧化物歧化酶類似。過氧硝酸鹽（ONOO-）是一氧化氮（NO）和O2.-快速反應(yīng)生成的一種高活性氧化劑，也是所有NO細(xì)胞毒素作用的主要介質(zhì)。最近研究發(fā)現(xiàn)，LA和DHLA能與過氧硝酸鹽反應(yīng)，從而在削弱過氧硝酸鹽對細(xì)胞的損傷中發(fā)揮重要作用[42]。

3.2 螯合金屬陽離子 LA除了能夠直接清除ROS外，還能夠在體內(nèi)外通過過渡態(tài)金屬離子螯合作用發(fā)揮抗氧化作用。LA在體外是一種有效的二價離子螯合劑，它能夠與Mn2+、Cu2+、Fe2+和Zn2+等過渡態(tài)金屬離子形成穩(wěn)定復(fù)合物。Ou等[43]已經(jīng)證實，LA對Cu2+催化的維生素C的氧化作用具有嚴(yán)重的劑量依賴性抑制作用，LA也能夠抑制Cu2+催化的脂質(zhì)過氧化。Suh等[44]報道，LA對老年鼠腦鐵含量具有保護(hù)作用，從而降低衰老相關(guān)的氧化應(yīng)激。在大腦中，DHLA介導(dǎo)的鐵和銅的螯合作用通過降低自由基損傷對阿爾茨海默癥的病理過程發(fā)揮積極作用[45]。體外研究證明DHLA能夠阻止Cu2+介導(dǎo)的低密度脂蛋白的氧化[46]。因此，體內(nèi)外試驗均表明螯合金屬陽離子是LA發(fā)揮其抗氧化作用的重要途徑。

3.3 親電子作用 細(xì)胞在較高濃度的氧氣中會產(chǎn)生過量ROS，ROS能夠與膜磷脂反應(yīng)生成與氧化應(yīng)激相關(guān)的脂質(zhì)親電體。膜磷脂中多不飽和脂肪酸側(cè)鏈在LA作用下產(chǎn)生多種氧化態(tài)磷脂產(chǎn)物，包括氫過氧化物和環(huán)過氧化物以及多不飽和脂肪酸在內(nèi)的膜脂的過氧化作用會形成丙二醛、丙烯醛和4-羥基-2-壬烯醛（4-Hydroxy-2-Nonenal，HNE）等幾類活性化合物[47]。這些醛類化合物的產(chǎn)生主要是細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境中促氧化作用高于自然抗氧化能力進(jìn)而引起氧化應(yīng)激的結(jié)果。細(xì)胞在消除活性醛過程中使用的第一道防御機制是與谷胱甘肽（Glutathione，GSH）結(jié)合。可擴散的膜磷脂氧化產(chǎn)物是生物活性化合物的一個重要來源，此類生物活性化合物能夠?qū)?xì)胞蛋白質(zhì)、DNA和大分子進(jìn)行化學(xué)修飾。蛋白質(zhì)中，半胱氨酸殘基是HNE及其氧化產(chǎn)物4-氧烯醛（4-Oxononenal，4-ONE）的親核目標(biāo)[48]。

圖2 LA和DHLA誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的信號通路及其機制示意圖[49]

3.4 LA誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1（HO-1）表達(dá)和細(xì)胞保護(hù)作用 如圖2所示，HO-1屬于細(xì)胞保護(hù)和解毒基因家族，此類基因在其調(diào)控區(qū)具有抗氧化反應(yīng)元件（Antioxidant Response Element，ARE）（富含腺嘌呤（A）和尿嘧啶（U）的元件）[49]。HO-1是一種細(xì)胞保護(hù)分子，它具有強效的抗炎保護(hù)性能，此外，它的基本代謝物CO與血紅蛋白（Hb）結(jié)合時具有毒性作用[50]。HO-1在血管細(xì)胞中通過抑制黏連分子和促炎細(xì)胞因子的分泌發(fā)揮抗炎作用；人內(nèi)皮細(xì)胞中HO-1過表達(dá)抑制了血管細(xì)胞黏連分子-1的表達(dá)[51-53]。人單核細(xì)胞體外研究已經(jīng)證實LA通過核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear Transcription Factor-2 Related Factor，Nrf2）誘導(dǎo)HO-1表達(dá)[54]。最近，有研究正在探索LA預(yù)處理對暴露于As3+下的HepG2細(xì)胞中Nrf2敏感基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明LA預(yù)處理降低了Nrf2介導(dǎo)的反應(yīng)且對暴露于As3+下的HepG2細(xì)胞具有保護(hù)作用[55]。由此可見，LA可能通過Nrf2-ARE信號通路誘導(dǎo)HO-1和其他抗氧化酶的形成進(jìn)而對細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

3.5 激活生物體內(nèi)其他抗氧化劑 LA的化學(xué)反應(yīng)活性主要通過其二硫戊環(huán)實現(xiàn)。研究表明，LA/DHLA的氧化還原電勢為-320 mV，而GSH/GSSG的氧化還原電勢為-240 mV，這一差異表明，與GSH相比，DHLA能夠更好地發(fā)揮抗氧化損傷的作用，因此LA/DHLA氧化還原反應(yīng)被稱為“萬能抗氧化劑”[56]。如圖3所示，在生物學(xué)系統(tǒng)中，LA在NAD（P）H驅(qū)動酶特別是硫氧還蛋白（TRx）還原酶或NADPH依賴TRx還原酶（NRT）的作用下形成DHLA。DHLA能夠還原氧化型谷胱甘肽和二氫抗壞血酸使之生成GSH和維生素E。與此同時，此過程使氧氣充足時不飽和脂肪酸（LH）上脂質(zhì)自由基（L.）產(chǎn)生的過氧化氫自由基（LOO.）轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)過氧化物。GSH是抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵物質(zhì)，它在清除ROS和作為氧化還原緩沖劑方面具有重要的作用，可維持胞內(nèi)氧化還原環(huán)境處于平衡狀態(tài)。實際上，LA/DHLA氧化還原反應(yīng)能夠產(chǎn)生GSH、抗壞血酸（又稱維生素C）、α-生育酚（又稱維生素E）等，但不同的是，DHLA在清除自由基的過程中自身不被破壞，而且能夠從LA循環(huán)產(chǎn)生[49]。

4 LA對動物生殖細(xì)胞和早期胚胎的抗氧化作用

4.1 LA與精子細(xì)胞 研究發(fā)現(xiàn)，LA主要通過降低精子脂質(zhì)過氧化和提高抗氧化酶活性2個途徑在提高精子質(zhì)量和維護(hù)精子功能方面發(fā)揮保護(hù)作用。Ibrahim等[10]研究表明，0.02 mmol/mL LA能夠提高雄鹿精子運動能力和活力并降低精子DNA損傷。Yeni等[57]發(fā)現(xiàn)，LA顯著提高了油漆稀釋劑處理的小鼠附睪精子密度、活力和質(zhì)膜完整性，并顯著降低了畸形精子率，進(jìn)而證實LA在降低油漆稀釋劑的副作用方面具有一定的保護(hù)作用，從而對人類生活產(chǎn)生重要意義。此外，LA能夠促進(jìn)抗氧化相關(guān)酶活性、降低細(xì)胞凋亡從而保護(hù)冷凍精液品質(zhì)。Shen等[58]研究發(fā)現(xiàn)，在公豬精液冷凍膨脹劑中添加LA可顯著提高解凍后精子的運動能力，精子中超氧化物歧化酶、乳酸脫氫酶、谷氨酸草酰轉(zhuǎn)移酶和過氧化氫酶含量升高，人工授精結(jié)果表明6 mg/mL組妊娠率和窩產(chǎn)仔數(shù)顯著高于對照組。因此，LA通過降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和促進(jìn)抗氧化酶的形成來提高精子總抗氧化能力，進(jìn)而提高精子質(zhì)量及其受精能力。

圖3 抗氧化劑 LA和DHLA作用通路[49]

4.2 LA與卵母細(xì)胞成熟 卵母細(xì)胞中ROS過量升高導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是造成卵母細(xì)胞凋亡和發(fā)育潛能降低的主要原因。LA能夠降低卵母細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而提高其總抗氧化能力，最終提高卵母細(xì)胞發(fā)育潛能。Zhang等[11]研究表明，山羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加LA能夠提高卵母細(xì)胞成熟率及其抗氧化能力。Zavareh等[59]指出，LA能夠降低卵母細(xì)胞中ROS水平并提高其總抗氧化能力。以上研究表明，LA在提高山羊、小鼠等卵母細(xì)胞成熟過程中均發(fā)揮重要作用。除此之外，LA對提高玻璃化冷凍腔前卵泡的發(fā)育能力也具有重要作用。Hatami等[60]通過LA處理玻璃化冷凍腔前卵泡，顯著提高了卵母細(xì)胞總抗氧化能力并顯著降低其ROS水平，進(jìn)而對玻璃化冷凍和新鮮卵泡的發(fā)育發(fā)揮保護(hù)作用。

4.3 LA與早期胚胎發(fā)育 LA在削弱過量ROS對早期胚胎造成的氧化損傷方面發(fā)揮著重要作用。Zhang等[11]在體外成熟培養(yǎng)液中添加LA可顯著提高山羊體細(xì)胞核移植后的克隆胚胎發(fā)育能力。小鼠胚胎體外培養(yǎng)過程中添加10 μmol/L LA能夠降低ROS水平并提高滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)數(shù)[61]。老年雌鼠胚胎培養(yǎng)液中添加LA可顯著提高早期胚胎中線粒體活性、氧化還原相關(guān)基因表達(dá)水平、ATP含量和囊胚形成率[62]。由此可見，LA可以通過提高線粒體活性、降低ROS水平、促進(jìn)氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)等提高早期胚胎發(fā)育能力，但其發(fā)揮作用的信號通路仍需進(jìn)一步探究。

5 展 望

LA通過清除自由基、螯合金屬離子、促進(jìn)其他抗氧化物質(zhì)的形成等途徑發(fā)揮抗氧化作用，能夠降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、DNA損傷，提高細(xì)胞總抗氧化能力和抗氧化酶活性，從而維持精子細(xì)胞、卵母細(xì)胞和早期胚胎內(nèi)氧化還原狀態(tài)，最終提高早期胚胎發(fā)育能力。目前，LA在生殖細(xì)胞和早期胚胎中抗氧化作用機制及其相關(guān)通路尚不清晰，因此進(jìn)一步探討生殖細(xì)胞和早期胚胎中LA的分子作用機制具有重要意義。