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    CD36在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義

    2019-03-19 03:14:34李珍宋玉蘭傅橋妹曾超
    關(guān)鍵詞:組織化學(xué)細(xì)胞株宮頸癌

    李珍,宋玉蘭,傅橋妹,曾超

    (1.廣東醫(yī)科大學(xué) 病理學(xué)系,廣東 東莞 523808;2.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科,廣東 廣州 510006)

    宮頸癌是最常見女性惡性腫瘤之一,約83%病例發(fā)生于發(fā)展中國家,宮頸癌確診為早期的5年生存率為90%,晚期伴侵襲轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者預(yù)后較差,Ⅳ期患者5年生存率<20%,盡管外科手術(shù)、放化療等治療方式日趨完善,但復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是宮頸癌治療失敗的主要原因[1-2]。宮頸癌發(fā)病相關(guān)分子較為繁多且復(fù)雜,因此,探索與發(fā)病相關(guān)的新的分子標(biāo)志物對于宮頸癌的預(yù)防及靶向治療尤為重要。

    CD36又稱為GP88、GPⅢb,是一種蛋白分子量為88 kD的多功能跨膜糖蛋白受體,染色體定位7q11.2,最初發(fā)現(xiàn)于單核細(xì)胞及血小板,亦可表達(dá)于包括巨噬細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)等多種類型的血細(xì)胞,可作為長鏈脂肪酸受體、氧化低密度脂蛋白(OxLDLs)受體、血小板1(TSP1)受體、Ⅰ型膠原受體及內(nèi)皮細(xì)胞受體[3-4]參與機體生理或病理狀態(tài)下的不同生物學(xué)功能,包括血管生成、動脈粥樣硬化、吞噬作用、炎癥、脂質(zhì)代謝及凋亡細(xì)胞的去除[5]。目前為止,CD36與宮頸癌的關(guān)系尚未見報道,因此,本研究旨在探討CD36在宮頸癌中的表達(dá),分析其表達(dá)與宮頸癌臨床病理特點的相關(guān)性。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    選取2011年1月—2016年12月廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院宮頸癌患者102例。年齡25~76歲,中位年齡47歲;按病理分化程度:高分化29例,中分化37例,低分化36例;臨床TNM分期:Ⅰ期67例,Ⅱ、Ⅳ期35例;T分期:T1期75例,T2~T4期27例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例;所有病例均無遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移,臨床資料完整,病理診斷明確,術(shù)前均未接受放化療,且無其他基礎(chǔ)性疾病或急慢性病。同時選取46例癌旁正常組織為對照。

    1.2 試劑與方法

    1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測 一抗(鼠抗人單克隆抗體,1∶50)購于美國Santa Cruz公司,免疫組織化學(xué)試劑盒(含二抗,羊抗鼠,即用型)、DAB顯色試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)公司,改進(jìn)型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液購于碧云天生物技術(shù)公司。操作嚴(yán)格遵守試劑盒說明書操作規(guī)程,采用已知陽性組織作為陽性對照,PBS代替一抗作作陰性對照。具體操作步驟如下:烤片2 h,二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,抗原修復(fù)液高壓修復(fù),內(nèi)源性過氧化物酶阻斷15 min,動物非免疫血清室溫封閉1 h,滴加一抗4℃過夜,37℃孵生物素標(biāo)記的二抗1 h,之后滴加鏈酶抗生物素蛋白-過氧化物酶,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,水沖返藍(lán),1%鹽酸酒精分化,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡下觀察。

    1.2.2 蛋白提取及 Western blotting 篩選 一抗(鼠抗人單克隆抗體,1∶50)購于美國Santa Cruz公司,內(nèi)參(兔抗GAPDH多克隆抗體,1∶1 000)購于杭州賢至生物科技有限公司,二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔,1∶1 000)、RIPA、PMSF、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購于上海碧云天生物科學(xué)技術(shù)有限公司,蛋白磷酸酶抑制劑混合物購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司。3株宮頸癌細(xì)胞株(Hela、HCE1、C33a)細(xì)胞均來源于本課題組所在實驗室細(xì)胞庫冷凍保存細(xì)胞。具體操作步驟:取細(xì)胞培養(yǎng)箱中呈對數(shù)生長期細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗3次,加入現(xiàn)配裂解液(RIPA∶PMSF∶蛋白磷酸酶抑制劑為100∶1∶1),冰上迅速刮取蛋白,將混合液移至新的EP管,冰浴30 min,4℃12 000 r/min 離心 30 min,取上清液,蛋白定量后加入蛋白上樣緩沖液100℃ 變性,行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,1×TBST配置5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗4℃孵育過夜,1×TBST洗膜5 min×4次,二抗室溫孵育1 h,1×TBST洗膜5 min×4次,ECL 顯影,結(jié)果采用Image J軟件測定蛋白條帶灰度值。

    1.3 結(jié)果判定

    免疫組織化學(xué)染色結(jié)果均至少由2位病理診斷醫(yī)生進(jìn)行雙盲判定,判定標(biāo)準(zhǔn):包膜或胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒物質(zhì)可視為陽性,依據(jù)陽性細(xì)胞率和染色強度進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色評分:無著色0分,淡黃染色1分,棕黃色2分,棕褐色3分;每個高倍鏡視野計數(shù)100個細(xì)胞,隨機選取10個視野觀察進(jìn)行計數(shù),取其平均值作為陽性細(xì)胞數(shù),以陽性細(xì)胞數(shù)百分比計分:<5%為0分,≤10%為1分,11%~50%為2分,51%~75%為3分,≥75%為4分;再將染色強度與陽性細(xì)胞率計分作乘積分級:>3分為弱陽性(+),6~9分為中陽性(++),9~12分為強陽性(+++),凡(+)或(+)以上者均為陽性表達(dá)。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較采用t檢驗,計數(shù)資料以例(%)表示,比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 宮頸癌細(xì)胞株中CD36蛋白表達(dá)水平

    3株宮頸癌細(xì)胞株(C33a、HCE1、Hela)中CD36/GAPDH蛋白灰度比值分別為(4.6±1.3)、(43.3±2.6)、(45.8±3.4)%,比較 C33a細(xì)胞,CD36在 Hela、HCE1細(xì)胞中呈高表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=25.724和 22.054,P=0.002 和 0.002)。見圖1。

    圖1 CD36在宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)

    2.2 CD36在宮頸癌組織中的表達(dá)

    CD36蛋白陽性表達(dá)產(chǎn)物主要定位于胞質(zhì)或胞膜,免疫染色呈淡黃、棕黃或棕褐色(見圖2、3)。宮頸癌組織中CD36陽性表達(dá)率為72.5%(74/102),癌旁正常組織中CD36陽性表達(dá)率為21.7%(10/46),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=33.347,P=0.000)(見表1)。同時分析CD36在宮頸癌組織的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)CD36在不同年齡、臨床分期及T分期的宮頸癌患者之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而與腫瘤病理分化程度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)聯(lián),在高、中、低分化癌組織中CD36表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

    圖2 CD36在宮頸癌組織中的表達(dá) (SP×400)

    圖3 CD36在宮頸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)(SP×400)

    表1 CD36在宮頸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

    表2 CD36表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 例(%)

    3 討論

    研究表明,CD36作為一類多功能蛋白,通過結(jié)合不同配體除參與多種正常及異常生物學(xué)效應(yīng)外,還參與腫瘤形成的正反向調(diào)控過程。CD36作為血小板1(TSP-1)受體,可與TSP-1緊密結(jié)合并相互作用抑制腫瘤血管形成[6],可能對腫瘤發(fā)生、發(fā)展起負(fù)調(diào)控作用。然而,多數(shù)研究表明,在多種腫瘤進(jìn)展過程中CD36主要作為促癌基因參與腫瘤的調(diào)控。HALE等[7]研究顯示,CD36可作為惡性腫瘤的標(biāo)志物,與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān),且于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)CD36作為氧化磷脂受體與腫瘤干細(xì)胞的增殖相關(guān)。另一方面,腹膜含豐富的Ⅰ型膠原[8],KENNY等[9]表明CD36作為Ⅰ型膠原受體,其表達(dá)抑制可降低Ⅰ型膠原基質(zhì)黏附力,對腫瘤盆腔或腹腔轉(zhuǎn)移尤為重要。有研究表明,CD36亦可作為脂肪酸受體結(jié)合游離脂肪酸(FFA)后通過激活Wnt/β-catenin和TGF-β信號途徑介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),從而更有利于肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[10],同時有研究發(fā)現(xiàn),在腎小管上皮細(xì)胞中,CD36的表達(dá)抑制可通過調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá),激活Smad 2和ERK 1/2信號途徑,抑制Fibronectin合成,從而減緩EMT[11]。LADANYI等[12]在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)腫瘤周圍網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞可上調(diào)CD36表達(dá),而CD36可降低卵巢癌細(xì)胞葡萄糖氧化過程形成低氧腫瘤細(xì)胞,低氧腫瘤細(xì)胞通過清除血清磷脂內(nèi)游離脂肪酸(FFA),使外源性脂肪酸通過CD36轉(zhuǎn)運至腫瘤細(xì)胞,引起脂肪細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤生長、侵襲與轉(zhuǎn)移。PASCUAL等[13]研究表明,CD36作為脂肪酸受體可表達(dá)于人口腔癌細(xì)胞,該細(xì)胞在小鼠體內(nèi)具較高轉(zhuǎn)移潛能,且通過CD36抗體阻斷該受體后,小鼠體內(nèi)的腫瘤轉(zhuǎn)移情況明顯改善,原發(fā)腫瘤明顯萎縮甚至消失,表明CD36具有作為腫瘤靶向治療的潛能。

    本實驗研究采用Western blotting、免疫組織化學(xué)分別檢測CD36在宮頸癌細(xì)胞株、宮頸癌組織及癌旁正常宮頸上皮中的表達(dá)情況,并分析其與臨床病理因素的關(guān)系。實驗結(jié)果表明,CD36在宮頸癌組織中呈高表達(dá),陽性率高達(dá)72.5%,而癌旁正常組織中CD36陽性率為僅為21.7%,兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Western blotting結(jié)果亦證實宮頸癌細(xì)胞株亦可表達(dá)CD36蛋白。免疫組織化學(xué)結(jié)果提示,與癌旁正常組織相比,宮頸癌組織中CD36表達(dá)明顯增高,進(jìn)一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),CD36在宮頸癌中的表達(dá)與分化程度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)關(guān),初步證實CD36的表達(dá)與宮頸癌密切相關(guān),這可能與CD36作為脂肪酸受體,通過不同信號途徑參與腫瘤的EMT,亦或作為其他受體參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,具體作用機制有待進(jìn)一步研究。

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