S100β蛋白在腦損傷中的作用及重組人紅細(xì)胞生成素的干預(yù)機(jī)制研究*

楊柳，王穎潔，張莉，白雪梅

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院 兒科，遼寧 大連 116027）

隨著新生兒存活率提高，新生兒腦損傷及其伴隨的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥成為兒科領(lǐng)域關(guān)注的重要問題[1-2]。關(guān)于其發(fā)病機(jī)制及治療方面的研究也較多。為探尋更有效控制和治療新生兒腦損傷的方法，提高腦損傷新生兒的生存率及改善其預(yù)后，本課題對新生大鼠腦損傷發(fā)生前后S100β蛋白表達(dá)的變化及重組人紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin,rhEPO）應(yīng)用與否對S100β蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行比較，并在臨床觀察rhEPO應(yīng)用對新生兒腦損傷的療效及對外周血S100β蛋白表達(dá)的影響，從而有機(jī)地將動物實驗與臨床實驗結(jié)合起來，進(jìn)一步探討S100β蛋白在新生大鼠缺氧缺血性腦損傷中的意義；明確rhEPO對缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）新生大鼠S100β蛋白的調(diào)節(jié)作用及對新生兒腦損傷的治療價值，為rhEPO治療腦損傷提供理論依據(jù)，也為S100β蛋白對新生兒腦損傷的早期診斷、程度評估、療效及預(yù)后評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物實驗及分組處理

1.1.1 實驗動物 健康 2 日齡 SD 大鼠（清潔級，母鼠帶養(yǎng)）120只（P2），雌雄不限，體重8～15 g。

1.1.2 分組及處理 飼養(yǎng)至 7 日齡，隨機(jī)分成 3 組 ：假手術(shù)組、HIBD組和rhEPO組，每組40只。假手術(shù)組切開頸部皮膚，分離左頸總動脈后不予結(jié)扎，縫合切口后不做低氧處理。HIBD組和rhEPO組采用改良Rice法[3]復(fù)制HIBD模型，大鼠乙醚麻醉后，常規(guī)消毒切開頸部皮膚，分離并結(jié)扎左頸總動脈，縫合切口，待大鼠清醒后置于37℃恒溫水浴密閉缺氧艙中，以2 L/min流量向艙內(nèi)通入8%氧+92%氮混合氣體2 h。存活大鼠出現(xiàn)活動減少，間斷性抖動，鼻、耳部、四肢及尾部呈缺氧的青紫狀，呼吸加深加快，翻身能力、平衡能力及意識較差或存在障礙提示模型復(fù)制成功。rhEPO組在復(fù)制HIBD術(shù)后即刻腹腔注射rhEPO（北京四環(huán)生物制藥有限公司）5000u/（kg·次），假手術(shù)組及HIBD組復(fù)制模型后即刻給予腹腔注射等容積生理鹽水。

1.1.3 取樣及指標(biāo)檢測 各組大鼠分別在出生后第3、5和7天及注射生理鹽水和rhEPO后6和24h，第3和7天斷尾取血，每次1ml，離心得血清標(biāo)本，采用ELISA法檢驗血清中S100β蛋白表達(dá)水平。

1.2 臨床實驗

1.2.1 一般資料 選取2015年2月—2017年10月大連醫(yī)科大學(xué)附屬二院婦產(chǎn)科或新生兒科確診為腦損傷的新生兒25例（腦損傷組），其中輕度腦損傷15例，重度腦損傷10例；選擇同期出生的健康新生兒29例為對照組。腦損傷新生兒診斷：①出血性腦損傷：出血急性期MRI表現(xiàn)為T1WI無異常或稍低信號，T2WI呈高信號，亞急性期早期（即出血4～7d），T1WI呈高信號，T2WI稍低信號，慢性期（出血14d以后）T1WI和T2WI均為高信號。②缺血性腦損傷：局灶性缺血性腦損傷MRI表現(xiàn)為半卵圓中心、側(cè)腦室旁簇狀或線狀的短T1、短T2信號，DWI示受累腦組織明顯高信號；彌漫性缺血性損傷僅DWI表現(xiàn)為側(cè)腦室白質(zhì)大片狀高信號改變，神經(jīng)元軸突損傷表現(xiàn)為大腦皮層、丘腦、小腦、基底核、腦干部位DWI高信號。根據(jù)顱腦MRI結(jié)果并結(jié)合臨床確定診斷。本課題經(jīng)本院倫理委員會同意，與家長進(jìn)行溝通簽署知情同意書，取得家長簽字的知情同意書。

1.2.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn) ：入院時日齡 7d新生兒，符合腦損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)宮內(nèi)TORCH感染，嚴(yán)重先天性畸形，先天性心臟病，遺傳代謝性疾病，母親為甲狀腺疾病患者。

1.3 治療方法

腦損傷的新生兒均給予皮下注射rhEPO（北京四環(huán)生物有限公司，國藥準(zhǔn)字 S20083023），500u/（kg·次），3次/周，療程3～4周。

1.4 指標(biāo)檢測

腦損傷組在應(yīng)用rhEPO治療前和治療后第3、7和14天，分別留取外周靜脈血2ml，同一時間點取對照組血樣，將所有血樣進(jìn)行離心處理，取血清，采用ELISA法測定血清S100β蛋白濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間不同時間點比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠出生后不同時間的外周血S100β蛋白表達(dá)比較

3組大鼠出生后第3、5和7天外周血S100β蛋白表達(dá)比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的S100β蛋白表達(dá)無差異（F=0.374，P=0.689）；② 3組的 S100β 蛋白表達(dá)無差異（F=0.681，P=0.504）；③3組的S100β蛋白表達(dá)變化趨勢無差異（F=0.514，P=0.538）。見表1和圖1。

2.2 3組大鼠治療后不同時間的外周血S100β蛋白表達(dá)比較

3組大鼠治療后6和24h，第3和7天外周血S100β蛋白表達(dá)比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的S100β蛋白表達(dá)有差異（F=276.375，P=0.000）；② 3組的S100β蛋白表達(dá)有差異（F=238.175，P=0.000），rhEPO 組和 HIBD 組較假手術(shù)組高；③3組的S100β蛋白表達(dá)變化趨勢有差異（F=221.260，P=0.000）。見表2 和圖2。

表1 3組大鼠出生后不同時間的外周血S100β蛋白表達(dá)比較 （n=40，μg/L，±s）

表1 3組大鼠出生后不同時間的外周血S100β蛋白表達(dá)比較 （n=40，μg/L，±s）

組別 第3天 第5天 第7天假手術(shù)組 5.26±0.76 5.34±0.75 5.41±0.75 HIBD 組 5.39±0.72 5.32±0.74 5.39±0.74 rhEPO 組 5.28±0.69 5.27±0.70 5.37±0.69

圖1 3組大鼠出生后不同時間的外周血S100β蛋白表達(dá)比較 （n=40，±s）

表2 3組大鼠治療后不同時間的外周血S100β蛋白表達(dá)比較 （n=40，μg/L，±s）

表2 3組大鼠治療后不同時間的外周血S100β蛋白表達(dá)比較 （n=40，μg/L，±s）

組別 6 h 24 h 第3天 第7天假手術(shù)組 5.46±0.72 5.49±0.68 5.48±0.71 5.42±0.69 HIBD 組 10.29±1.06 9.72±1.02 10.56±1.36 9.05±1.21 rhEPO 組 8.34±0.96 7.11±0.89 9.01±1.15 6.51±0.99

圖2 各組大鼠治療后不同時間的外周血S100β蛋白表達(dá)比較 （n=40，±s）

2.3 兩組新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達(dá)比較

兩組新生兒治療前、治療后第3、7和14天外周血S100β蛋白表達(dá)比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的S100β蛋白表達(dá)有差異（F=4.085，P=0.000）；② 3 組 S100β 蛋白表達(dá)有差異（F=7.939，P=0.000），腦損傷組較對照組高 ；③ 3組S100β 蛋白表達(dá)變化趨勢有差異（F=2.123，P=0.044），腦損傷組外周血的S100β蛋白表達(dá)呈雙峰變化，見圖3和表3。

2.4 輕度和重度腦損傷新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達(dá)比較

3組治療前、治療后第3、7和14天外周血S100β蛋白表達(dá)比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點間的S100β蛋白表達(dá)有差異（F=12.771，P=0.000）；②3組S100β蛋白表達(dá)有差異（F=42.890，P=0.000），重度腦損傷組較其他兩組高；③3組S100β蛋白表達(dá)變化趨勢有差異（F=13.839，P=0.000），輕度和重度腦損傷新生兒組外周血的S100β蛋白表達(dá)呈雙峰變化。見表4和圖4。

圖3 兩組新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達(dá)比較 （±s）

表3 兩組新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達(dá)比較 （μg/L，±s）

表3 兩組新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達(dá)比較 （μg/L，±s）

組別 n 治療前治療后第3天 第7天 第14天對照組 29 5.32±1.03 5.39±1.09 5.28±1.11 5.19±1.15腦損傷組 25 13.24±3.68 7.26±2.17 9.15±2.34 6.13±2.04

表4 輕度和重度腦損傷新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達(dá)比較 （μg/L，±s）

表4 輕度和重度腦損傷新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達(dá)比較 （μg/L，±s）

組別 n 治療前治療后第3天 第7天 第14天對照組 29 5.32±1.03 5.39±1.09 5.28±1.11 5.19±1.15輕度腦損傷組 15 11.98±3.16 6.48±2.05 6.52±1.96 5.48±1.09重度腦損傷組 10 15.13±3.73 8.43±2.29 13.10±3.69 7.11±1.36

圖4 輕度和重度腦損傷新生兒治療前后外周血S100β蛋白表達(dá)比較 （±s）

3 討論

隨著早產(chǎn)兒及重度缺氧缺血性腦病新生兒存活率提高，新生兒缺氧缺血性腦損傷及其伴隨的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥成為兒科領(lǐng)域關(guān)注的重要問題[4-6]。發(fā)病率有逐年上升的趨勢，關(guān)于其發(fā)病機(jī)制及治療方面的研究也較多。

S100β蛋白，作為中樞神經(jīng)特異蛋白，存在于神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突細(xì)胞中，通過鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝及信號傳遞[7-8]。發(fā)生腦損傷時過量的S100β蛋白刺激膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子、一氧化碳NO導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。S100β蛋白是由膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，作用于神經(jīng)元及其周圍的環(huán)境，是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元相互聯(lián)系的中介物質(zhì)之一，在腦的發(fā)育過程中和腦損傷時S100β蛋白是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，適量表達(dá)對腦組織起營養(yǎng)保護(hù)作用。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)過量時，加速神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的惡化，并導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。正常情況下，S100β蛋白不能通過血-腦屏障進(jìn)入血液，但在一些病理情況下可檢測到血清S100β升高。發(fā)生腦損傷時過量的S100β蛋白刺激膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子、NO導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。因此，有學(xué)者認(rèn)為S100β蛋白是迄今最能反映腦損傷程度的特異性蛋白，由于S100β蛋白在腦損傷后有很好的時間變化規(guī)律，而且與腦損傷程度有緊密相關(guān)性，穩(wěn)定性又比其他神經(jīng)生化指標(biāo)高，研究其在腦損傷后的動態(tài)規(guī)律變化，將能從分子水平細(xì)胞水平給腦損傷程度和治療效果提供依據(jù)[9-10]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，不論出生第7天的HIBD新生鼠或第7天診斷為腦損傷的新生兒，外周血的S100β蛋白均增高，可見HIBD新生鼠或診斷為腦損傷的新生兒均存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損的情況。

有文獻(xiàn)顯示，腦損傷大腦各部位的S100β表達(dá)呈雙峰變化，如皮質(zhì)部、海馬和丘腦均有雙峰的變化，雖然各部位雙峰出現(xiàn)時間略有差異，但趨勢相似，本結(jié)果顯示，HIBD組外周血S100β表達(dá)在第3和14天呈低值，給藥前和給藥第7天呈高值，與缺血再灌注的二次腦損傷相關(guān)，雙峰程度也與預(yù)后相關(guān)。病情較輕或預(yù)后良好的腦損傷新生兒在發(fā)病時S100β蛋白呈高表達(dá)，隨著治療時間延長，外周血S100β蛋白呈降低趨勢，病情較重或預(yù)后不佳患兒外周血S100β蛋白雙峰現(xiàn)象明顯，因此也有法醫(yī)報道將S100β蛋白水平作為生前傷及死后傷鑒別的主要指標(biāo)，但本課題隨訪時間較短，病情較輕或預(yù)后良好的腦損傷新生兒也可能存在S100β蛋白的雙峰表達(dá)，而且新生兒的血腦屏障發(fā)育尚不成熟S100β蛋白的穿透性也較高，且S100β蛋白在不同的組織也有表達(dá)，致使腦損傷新生兒的S100β蛋白在外周血的表達(dá)更為復(fù)雜，因此有必要擴(kuò)大樣本和延長時間檢測。

針對新生兒腦損傷神經(jīng)保護(hù)的研究雖然很多，但是目前尚無一種理想的藥物應(yīng)用于臨床，因此，尋找新型高效的腦保護(hù)藥物以防治新生兒腦損傷是臨床上亟待解決的難題。本研究結(jié)果顯示，不論新生大鼠及新生兒腦損傷，給予rhEPO均可降低外周血S100β蛋白水平達(dá)到治療的目的。rhEPO是一種作用于造血細(xì)胞，促進(jìn)紅細(xì)胞生成的糖蛋白[11-12]，rhEPO能參與rhEPO受體信號通路，以信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的身份調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號的傳遞[13]。國內(nèi)外多項臨床研究發(fā)現(xiàn)[13-15]，應(yīng)用rhEPO能夠促進(jìn)早產(chǎn)兒腦和神經(jīng)發(fā)育，減輕新生兒缺氧缺血性腦損傷時早期腦損害、促進(jìn)后期神經(jīng)元及少突細(xì)胞的分化、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡等，新生動物或新生兒經(jīng)腹或皮下注射rhEPO能提高其神經(jīng)行為能力，rhEPO對心臟也具有良好的保護(hù)作用。腦卒中新生鼠實驗中，rhEPO可縮小雌性鼠腦梗死范圍，提高遠(yuǎn)期神經(jīng)預(yù)后。rhEPO為神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和存活提供了新途徑。在動物模型研究中已證實rhEPO可通過一系列廣泛的細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡是目前研究最深入的機(jī)制之一[16-17]。

綜上所述，S100β蛋白在新生大鼠及新生兒腦損傷可呈雙峰變化，其中輕度新生兒腦損傷的S100β蛋白無雙峰變化，rhEPO可用于治療新生大鼠及新生兒腦損傷。但是有關(guān)RHEPO對S100β蛋白的調(diào)節(jié)作用等方面的問題有待于進(jìn)一步研究。