兒茶酚胺抑素在自發(fā)性高血壓大鼠交感神經(jīng)活化中的作用*

郭建強，李素娟，賈宇臣

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.心內(nèi)科，2.消化內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

嗜鉻粒蛋白A是一種酸性、親水性分泌蛋白，分布于交感神經(jīng)節(jié)后神經(jīng)元及腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻性顆粒內(nèi)，與兒茶酚胺共同儲存在分泌囊泡中[1]。兒茶酚胺抑素（Catestatin）是嗜鉻粒蛋白A中含21個氨基酸殘基的分泌片段，能以負(fù)反饋的形式抑制兒茶酚胺的釋放，因此具有抑制交感神經(jīng)活性的作用[2-3]，而交感神經(jīng)系統(tǒng)激活是高血壓重要的病理生理機制[4]。自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHR）是研究高血壓的理想模型[5]。本研究擬通過檢測SHR不同發(fā)育階段血漿Catestatin濃度的變化規(guī)律及給該大鼠尾靜脈注射Catestatin后的心率變化，探討Catestatin在高血壓交感神經(jīng)活化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級雄性大鼠，購自北京維通利華公司，動物合格證號為11400700077784。SHR（SHR組）和正常血壓大鼠（Wistar-Kyoto rats,WKY）（WKY組），每組7只，普通飼料喂養(yǎng)，自由進食。實驗室恒溫（22～24℃）、恒濕（相對濕度：60%），光亮自動切換（亮12 h，8：00～20：00；暗12 h，20：00～8：00）。本研究的動物實驗方案由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 材料、試劑與儀器

Catestatin多肽序列為RSMRLSFRARGYGFRDPG LQL，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，BP-98AL智能無創(chuàng)血壓測量儀由北京軟隆生物技術(shù)有限公司提供，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國Phoenix Pharmaceuticals公司）購自康肽生物科技（北京）有限公司，美國SpectraMax iD3多功能酶標(biāo)儀，抑肽酶購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，貨號A1153。

1.3 血壓和心率的測量

采用尾套法檢測兩組6、12及16周齡大鼠的血壓及心率。具體操作步驟根據(jù)BP-98AL產(chǎn)品說明書進行。將待測大鼠置于安靜、溫暖的環(huán)境中。適應(yīng)30 min后將大鼠放在鼠袋中，保持恒溫，然后將感應(yīng)器置于大鼠的尾根部，按下開始鍵，BP-98AL自動監(jiān)測大鼠尾部的血流脈動，當(dāng)判定脈波穩(wěn)定時，自動開始測量，從測壓儀上讀取收縮壓、舒張壓、平均動脈壓和心率數(shù)據(jù)，連測5次，取其平均值。

給12周齡SHR尾靜脈注射合成的Catestatin，劑量為3 μg/g體重。Catestatin注射劑量參考文獻(xiàn)[6]，30 min后檢測血壓及心率，方法同前。

1.4 血漿Catestatin的檢測

采用ELISA測定血漿Catestatin水平。分別在大鼠的6、12及16周齡時從眼眶靜脈叢留取血標(biāo)本0.3～0.4 ml，大鼠繼續(xù)培養(yǎng)。血標(biāo)本立即以 3 000 r/min，離心半徑7.5 cm，離心10 min，分離血漿，加入10%EDTA-2Na（1 mg/ml）和抑肽酶 2 500 IU/ml（A1153,Sigma），置入-80℃冰箱冷凍儲存待測。根據(jù)ELISA試劑盒的操作說明書進行。在每孔中加入50 μl的樣本、標(biāo)準(zhǔn)品和陽性對照，隨后每孔中加入25 μl的結(jié)合蛋白、生物素，在室溫下孵育2 h，后加入辣根過氧化物酶溶液100 μl/孔，室溫下孵育1 h。最后加入底物溶液100 μl/孔，1 h后終止反應(yīng)，在450 nm讀取光密度（OD）值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用配對t檢驗或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體重、血壓、心率及Catestatin濃度的變化情況

兩組大鼠體重比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同周齡大鼠的體重有差異（F=528.100，P=0.000）；②兩組大鼠體重有差異（F=85.813，P=0.000），SHR組的體重小于WKY組；③兩組大鼠體重隨周齡的變化趨勢有差異（F=15.635，P=0.000），WKY組體重隨周齡增加的更快。見表1和圖1。

兩組大鼠血壓比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同周齡大鼠的血壓有差異（收縮壓：F=70.913，P=0.000，舒張壓 ：F=37.938，P=0.000）；②兩組間血壓有差異（收縮壓：F=429.93，P=0.000，舒 張 壓：F=211.850，P=0.000），SHR組血壓高于WKY組；③兩組血壓變化的趨勢有差異（收縮壓：F=61.622，P=0.000，舒張壓 ：F=32.914，P=0.000），SHR組血壓隨周齡增長呈增加趨勢，WKY組保持不變。見表2和圖2。

兩組大鼠心率比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同周齡大鼠的心率有差異（F=6.618，P=0.005）；②兩組間心率有差異（F=51.021，P=0.005），SHR組心率高于WKY組；③兩組心率隨周齡增加的變化趨勢有差異（F=0.395，P=0.678）。見表3和圖3。

兩組大鼠血漿Catestatin濃度比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同周齡大鼠的血漿Catestatin濃度有差異（F=15.101，P=0.000）；②兩組間血漿 Catestatin濃度有差異（F=129.198，P=0.000），SHR組Catestatin濃度高于WKY組，SHR組的Catestatin濃度隨周齡的增加逐漸升高，而WKY組則保持不變；③兩組血漿Catestatin濃度變化趨勢有差異（F=11.697，P=0.000）。見表4和圖4。

表1 兩組大鼠體重的比較（n=7，g，±s）

表1 兩組大鼠體重的比較（n=7，g，±s）

組別 6周 12周 16周WKY 組 157.0±13.6 302.9±12.6 330.3±15.1 SHR 組 141.9±12.2 238.9±14.8 268.9±16.4

圖1 兩組大鼠體重變化趨勢

表2 兩組大鼠血壓的比較 （n=7，mmHg，±s）

表2 兩組大鼠血壓的比較 （n=7，mmHg，±s）

注：1 mmHg=0.133 kPa

收縮壓組別舒張壓6周 12周 16周 6周 12周 16周WKY 組 118.9±7.9 123.0±5.7 119.7±4.4 85.7±7.2 91.1±8.1 80.6±8.9 SHR 組 146.6±7.5 193.3±11.7 205.4±8.9 107.7±4.7 153.1±9.7 145.6±13.3

圖2 兩組大鼠收縮壓、舒張壓變化趨勢

表3 兩組大鼠心率的比較（n=7，次 /min，±s）

表3 兩組大鼠心率的比較（n=7，次 /min，±s）

組別心率6周 12周 16周WKY 組 363±18 346±18 344±15 SHR組 415±21 398±22 404±11

圖3 兩組大鼠心率變化趨勢

2.2 Catestatin對SHR心率和血壓的影響

與給藥前比較，給藥后30min心率有下降（P＜0.05），但血壓無變化。見表5。

表4 兩組大鼠血漿Catestatin濃度比較（n=7，ng/ml，±s）

表4 兩組大鼠血漿Catestatin濃度比較（n=7，ng/ml，±s）

組別血漿Catestatin濃度6周 12周 16周WKY 組 1.10±0.28 1.05±0.21 1.17±0.12 SHR 組 1.60±0.54 1.76±0.26 3.03±0.57

圖4 兩組大鼠血漿Catestatin濃度變化趨勢

表5 Catestatin 對心率和血壓的影響 （n=7，±s）

表5 Catestatin 對心率和血壓的影響 （n=7，±s）

心率 /（次/min）給藥前 196.3±4.3 150.0±8.7 417.6±20.9給藥后 30 min 197.0±6.4 144.4±8.8 378.1±15.6 t值 -0.306 2.032 6.604 P值 0.770 0.088 0.001組別 收縮壓/mmHg舒張壓/mmHg

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，SHR組不僅血壓高于WKY組，心率也高于WKY組，說明交感神經(jīng)激活是高血壓的重要發(fā)病機制。目前已有一些學(xué)者對Catestatin與高血壓的關(guān)系進行初步的研究。O'CONNOR等[7]研究表明，不僅高血壓患者血漿Catestatin水平是降低的，而且在有高血壓家族史但尚未出現(xiàn)高血壓的人群中Catestatin也是降低的。但后續(xù)的研究結(jié)果并不一致，MENG等[8]研究顯示，高血壓患者血漿Catestatin水平升高，Catestatin/去甲腎上腺素的比值降低。而且在另外一些伴有交感神經(jīng)激活的心血管疾病，比如心力衰竭、急性心肌梗死、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中，血漿Catestatin也升高[9-11]。從該既往的研究結(jié)果可以看出，Catestatin和交感神經(jīng)激活有密切的關(guān)系。但上述研究均為橫斷面的調(diào)查，本研究在SHR組的發(fā)育過程中的不同階段進行檢測，發(fā)現(xiàn)血漿Catestatin的水平是逐漸升高的，與此同時，WKY組大鼠則無這種趨勢，進一步提示Catestatin可能參與高血壓的發(fā)病過程，也彌補了既往研究的缺陷。

KENNEDY等[6]研究表明，Catestatin能夠抑制電刺激大鼠引起的血壓及心率的升高。MAHAPATRA等[12]研究則表明，小鼠基因敲除嗜鉻粒蛋白A可引起高血壓，外源性補充Catestatin能夠降低血壓血壓正常。FUNG等[13]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用苯腎上腺素可誘導(dǎo)血管收縮，隨后予以Catestatin可使收縮的血管舒張。本研究均提示，Catestatin可抑制與交感神經(jīng)活化相關(guān)的血壓升高。

在本研究中，盡管SHR組血漿中Catestatin升高，本室仍然尾靜脈注射給予Catestatin治療，發(fā)現(xiàn)可下降SHR組的心率。這說明Catestatin具有在實際高血壓個體中具有抑制交感神經(jīng)活性的作用，也說明SHR組血漿中Catestatin的升高是交感神經(jīng)活性增高的一種代償反應(yīng)。Catestatin未能降低血壓，筆者認(rèn)為可能是單一的Catestatin治療不足以使血壓下降。也可能是給藥途徑的問題，比如近期發(fā)表的另外一項研究表明，從中樞神經(jīng)系統(tǒng)泵入Catestatin可下降血壓[14]。

就目前的研究結(jié)果而言，Catestatin能夠抑制交感神經(jīng)活化的指標(biāo)均為心率、血壓以及血漿中的去甲腎上腺素水平，該指標(biāo)都是血流動力學(xué)方面的間接反映交感神經(jīng)的方法，而未直接記錄交感神經(jīng)活化程度的指標(biāo)，比如，微神經(jīng)圖技術(shù)記錄傳出神經(jīng)節(jié)肌肉交感神經(jīng)放電率，放射性標(biāo)記的去甲腎上腺素溢出率的測定[15]，以及交感神經(jīng)纖維的直接標(biāo)記[16]，未來的研究需要應(yīng)用該指標(biāo)進一步驗證Catestatin的抗交感激活作用。