右美托咪定在大鼠腦出血延遲低溫治療中的作用

梁威，彭曉紅

[武漢市第四醫(yī)院（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛(ài)醫(yī)院） 麻醉科，湖北 武漢 430032]

腦出血（cerebral hemorrhage,CH）是由于高血壓、腦血管畸形等引起的腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管自發(fā)破裂出血，為臨床常見(jiàn)的急癥之一[1]。腦出血起病突然、進(jìn)展快，具有發(fā)病率高，致殘、病死率高的特點(diǎn)，好發(fā)于45歲以上人群。流行病學(xué)資料顯示，全球每年約有200萬(wàn)人罹患腦出血，總發(fā)病率為24.6/10萬(wàn)人，占全部腦卒中的15%～20%[2]，我國(guó)發(fā)病率處于世界較高水平，約為60/10萬(wàn)～80/10萬(wàn)，占腦卒中的21%～48%，急性期病死率高達(dá)38%～43%[3]，并且近年來(lái)有逐漸升高的趨勢(shì)，給患者和家庭造成很大痛苦。對(duì)于腦出血，目前臨床上以防止再出血及對(duì)癥治療為主，尚無(wú)特效治療方案。亞低溫是一種物理性的神經(jīng)保護(hù)手段，主要通過(guò)將體溫降至32～34℃來(lái)發(fā)揮治療作用，已經(jīng)有研究顯示，亞低溫治療能減輕腦出血所致的血腫和血腫周圍水腫，改善預(yù)后[4]。右美托咪定為α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，屬于鎮(zhèn)靜催眠藥物，可用于腦出血術(shù)后鎮(zhèn)靜[5]。有研究認(rèn)為，右美托咪定聯(lián)合淺低溫治療對(duì)腦缺血損傷大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[6]，而關(guān)于兩者聯(lián)合治療腦出血的研究較少，本研究探討右美托咪定在大鼠腦出血后延遲低溫治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠 95只，周齡為8～10周，體重300～360 g，平均（332.46±15.13）g，購(gòu)自廣州醫(yī)藥研究總院有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（粵）2013～0003。將大鼠5只/籠分籠飼養(yǎng)，喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料及消毒的自來(lái)水，自由活動(dòng)與進(jìn)食水，飼養(yǎng)室內(nèi)安靜、清潔、通風(fēng)，溫度在25℃左右，晝夜時(shí)間比為12 h∶12 h，定期更換清潔墊料。

1.1.2 主要藥品與試劑 鹽酸右美托咪定注射液，規(guī)格：2 ml/支，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20110097，四川（樂(lè)山）國(guó)瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司；肝素鈉注射液，規(guī)格：12 500 u/支，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H32021978，蘇州新寶制藥有限公司；2%戊巴比妥鈉、Ⅶ型膠原酶，美國(guó)Sigma公司；檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0），上海信裕生物科技有限公司；TUNEL色標(biāo)法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，美國(guó)ScienCell公司；大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、白細(xì)胞介素 8（interleukin 8,IL-8）、神經(jīng)元烯醇化酶（neuron specific enolase,NSE）、S100β蛋白（S100β）ELISA試劑盒，無(wú)錫東林科技發(fā)展有限責(zé)任公司。Ⅶ型膠原酶溶于滅菌生理鹽水中，制備濃度為1 u/μl的Ⅶ型膠原酶溶液，置入-20℃冰箱冷凍保存。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 大鼠腦立體定位儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），微量進(jìn)樣器（武漢賽維爾生物科技有限公司），GTR10-1型低溫離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司），EP220A電子天平（瑞士Precisa公司），DM3000熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司），F(xiàn)reedom EVOlyzer?全自動(dòng)酶免分析儀（瑞士Tecan公司）。

1.2 方法

1.2.1 復(fù)制模型及實(shí)驗(yàn)方法 經(jīng)過(guò)為期 1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組19只和手術(shù)組76只，手術(shù)組又分為模型組、延遲低溫組、右美托咪定組、右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組，每組19只。手術(shù)組采用立體定向尾狀核注射法復(fù)制腦出血模型，復(fù)制模型前8 h禁食水，稱重，腹腔注射2%戊巴比妥鈉0.1 ml/kg以麻醉大鼠，右美托咪定組和右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組給予鹽酸右美托咪定注射液100 μg/kg腹腔注射，假手術(shù)組、模型組、延遲低溫組給予等量生理鹽水腹腔注射；之后將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，頭部備皮、消毒，于眼耳之間正中作一長(zhǎng)度為1.5～2.0 cm的矢狀切口，暴露顱骨，采用牙科鉆在前囟前0.2 mm，中線右側(cè)旁開(kāi)3.0 mm處鉆孔，暴露硬腦膜；采用微量進(jìn)樣器吸取0.26 μl Ⅶ型膠原酶和肝素混合液（0.5 μl Ⅶ型膠原酶 +0.5 μl肝素），沿骨孔垂直進(jìn)針5.0 mm緩慢注射，留針10 min后退出，常規(guī)清潔、消毒、縫合傷口，待大鼠蘇醒放回籠中飼養(yǎng)[7]。術(shù)后2 h，大鼠Berderson神經(jīng)癥狀評(píng)分[8]等級(jí)為1～3級(jí)，即為模型復(fù)制成功，過(guò)程中若有大鼠意外死亡或復(fù)制失敗，則取備用大鼠補(bǔ)充；假手術(shù)組手術(shù)操作方式與手術(shù)組相同，但不向顱內(nèi)注射藥物。術(shù)畢12 h，將延遲低溫組、右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組大鼠間斷置于5℃養(yǎng)育箱內(nèi)飼養(yǎng)12 h，保持大鼠肛溫為32～34℃，模型組、假手術(shù)組、右美托咪定組大鼠置于25℃養(yǎng)育箱內(nèi)飼養(yǎng)12 h。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損程度量表（neurological deficit score,NDS）評(píng)分 復(fù)制大鼠腦出血模型 48 h 后，從自發(fā)性轉(zhuǎn)圈、后肢回縮、雙側(cè)前爪抓握、雙側(cè)前肢屈曲、橫梁行走5個(gè)方面對(duì)大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，每個(gè)方面根據(jù)嚴(yán)重程度不同分值為0～3分，總分為0～15分，得分越高，提示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重[9]。

1.2.3 標(biāo)本采集與處理 NDS 評(píng)分測(cè)定結(jié)束后，腹腔注射2 %戊巴比妥鈉0.1 ml/kg麻醉大鼠，采用斷頭法取血 3 ml，置于離心管內(nèi)，在 4℃、3 000 r/min 離心10 min，獲得血清，置于-20℃冰箱保存；打開(kāi)顱骨取腦，自中線切開(kāi)，切取血腫周圍腦組織，其中1/2用于腦組織水分含量檢測(cè)；剩余1/2腦組織采用10%中性緩沖甲醛固定液固定、梯度濃度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制備厚度為4 μm的組織切片備檢。

1.2.4 腦組織水分含量檢測(cè) 將取出的 1/2 血腫周圍腦組織進(jìn)行沖洗及吸干表面水分，稱量濕重（g），之后置于60℃烤箱內(nèi)烘干，48 h后重量恒定時(shí)稱量干重（g），根據(jù)腦組織水分含量=（濕重-干重）/濕重×100%進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 TUNEL 法檢測(cè)血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡 取出腦組織石蠟切片，采用二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，將切片置于0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中，微波高檔煮沸10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，按照TUNEL色標(biāo)法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，常規(guī)封片，采用熒光顯微鏡觀察切片，在高倍鏡（×400）下，隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)TUNE染色陽(yáng)性細(xì)胞核（呈棕褐色）個(gè)數(shù)以及細(xì)胞核總數(shù)，根據(jù)凋亡指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.2.6 血清炎癥細(xì)胞因子和腦損傷標(biāo)志物水平檢測(cè)取出大鼠血清，采用Freedom EVOlyzer ?全自動(dòng)酶免分析儀，依據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，檢測(cè)血清TNF-α、IL-8、NSE、S100β水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，方差齊用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠NDS評(píng)分及腦組織水分含量比較

5組大鼠NDS評(píng)分及腦組織水分含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，手術(shù)各組大鼠NDS評(píng)分及腦組織水分含量與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），手術(shù)各組均有升高；與模型組比較，延遲低溫組、右美托咪定組及右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組大鼠NDS評(píng)分及腦組織水分含量較低，且延遲低溫組和右美托咪定組與右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），延遲低溫組和右美托咪定組均高于右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠NDS評(píng)分及腦組織水分含量比較（n=19，±s）

表1 各組大鼠NDS評(píng)分及腦組織水分含量比較（n=19，±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與延遲低溫組比較，P＜0.05；4）與右美托咪定組比較，P＜0.05

組別 NDS評(píng)分 腦組織水分含量/%假手術(shù)組 1.37±0.17 62.45±7.32模型組 10.53±1.381） 86.56±9.21延遲低溫組 7.31±0.791）2） 75.84±8.041）2）右美托咪定組 7.26±0.831）2） 75.43±8.271）2）右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組 4.57±0.621）2）3）4） 67.36±5.471）2）3）4）F值 308.037 26.761 P值 0.000 0.000

2.2 各組大鼠血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

5組大鼠血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，手術(shù)各組大鼠血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），手術(shù)各組均有升高；與模型組比較，延遲低溫組、右美托咪定組及右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組大鼠血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)較低，且延遲低溫組和右美托咪定組的凋亡指數(shù)與右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），延遲低溫組和右美托咪定組均大于右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組。見(jiàn)表2和附圖。

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-8水平比較

5組大鼠血清TNF-α、IL-8水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，手術(shù)各組大鼠血清TNF-α、IL-8水平與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），手術(shù)各組均有升高；與模型組比較，延遲低溫組、右美托咪定組及右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組大鼠血清TNF-α、IL-8水平較低，且延遲低溫組和右美托咪定組與右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），延遲低溫組和右美托咪定組均高于右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（n=19，±s）

表2 各組大鼠血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（n=19，±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與延遲低溫組比較，P＜0.05；4）與右美托咪定組比較，P＜0.05

組別 凋亡指數(shù)假手術(shù)組 1.19±0.15模型組 27.45±3.021）延遲低溫組 17.87±2.081）2）右美托咪定組 17.56±2.241）2）右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組 10.94±1.361）2）3）4）F值 440.271 P值 0.000

附圖 血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡情況 （TUNEL×400）

2.4 各組大鼠血清NSE、S100β水平比較

5組大鼠血清NSE、S100β水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，手術(shù)各組大鼠血清NSE、S100β水平與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），手術(shù)各組均有升高；與模型組比較，延遲低溫組、右美托咪定組和右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組大鼠血清NSE、S100β水平較低，且延遲低溫組和右美托咪定組與右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），延遲低溫組和右美托咪定組均高于右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組。見(jiàn)表4。

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-8水平比較（n=19，mg/dl，±s）

表3 各組大鼠血清TNF-α、IL-8水平比較（n=19，mg/dl，±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與延遲低溫組比較，P＜0.05；4）與右美托咪定組比較，P＜0.05

組別 TNF-α IL-8假手術(shù)組 0.45±0.06 0.16±0.02模型組 0.98±0.141） 0.87±0.121）延遲低溫組 0.86±0.091）2） 0.68±0.061）2）右美托咪定組 0.81±0.111）2） 0.62±0.071）2）右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組 0.67±0.081）2）3）4） 0.33±0.041）2）3）4）F值 78.652 308.159 P值 0.000 0.000

表4 各組大鼠血清NSE、S100β水平比較（n=19，±s）

表4 各組大鼠血清NSE、S100β水平比較（n=19，±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與延遲低溫組比較，P＜0.05；4）與右美托咪定組比較，P＜0.05

組別 NSE/（μg/L） S100β/（mg/dl）假手術(shù)組 6.36±0.85 1.65±0.21模型組 26.44±3.121） 10.88±1.371）延遲低溫組 20.75±2.241）2） 7.83±1.111）2）右美托咪定組 20.48±2.321）2） 7.26±1.031）2）右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組 14.08±1.941）2）3）4） 4.91±0.641）2）3）4）F值 226.776 244.410 P值 0.000 0.000

3 討論

腦出血是導(dǎo)致人類死亡的三大主要原因之一，常見(jiàn)的病因有高血壓伴小動(dòng)脈硬化、微動(dòng)脈瘤、煙霧病、顱內(nèi)靜脈血栓形成、血栓性血小板減少癥等，氣候變化、情緒激動(dòng)、用力過(guò)猛等因素也可誘發(fā)。腦出血后繼發(fā)的血腫周圍水腫是患者病情進(jìn)展的主要原因之一，包括血管源性水腫、細(xì)胞毒性水腫兩種類型。血管源性水腫與血腦屏障受損、組織間隙身份增多有關(guān)，細(xì)胞毒性水腫則與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)由于缺血、缺氧、中毒受損有關(guān)，血腫占位壓迫、中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)、凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)等均參與血腫形成過(guò)程，加重腦組織損傷[10]。在腦出血的治療中，及時(shí)有效地控制腦水腫是改善治療效果的關(guān)鍵。亞低溫治療由BUSTO于1987年提出，是應(yīng)用于腦卒中和顱腦損傷的腦保護(hù)手段，該治療方式能夠降低腦代謝率、改善腦血流循環(huán)、保護(hù)血腦屏障、抑制氧自由基、炎癥因子、興奮性氨基酸等內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)腦細(xì)胞的損害作用、調(diào)控基因表達(dá)減少神經(jīng)元凋亡等，起到神經(jīng)保護(hù)作用[11]。延遲低溫治療多于腦出血后12 h開(kāi)始，此時(shí)既能減輕血腫相關(guān)損傷，又避免血壓升高、凝血功能異常等并發(fā)癥影響治療效果[12]。右美托咪定為鎮(zhèn)靜催眠藥物，也具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用可能通過(guò)抑制兒茶酚胺釋放、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、抗氧化、抑制神經(jīng)元凋亡、抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)、激活咪唑啉Ⅰ受體等機(jī)制體現(xiàn)出來(lái)[13]。已有研究認(rèn)為，右美托咪定有通過(guò)調(diào)節(jié)血腫周圍腦組織Bcl-2/Bax表達(dá)，抑制腦出血大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的作用[14]。

本研究采用立體定向尾狀核注射法復(fù)制大鼠腦出血模型，并分別采用延遲亞低溫療法、右美托咪定腹腔注射進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，與模型組比較，各組大鼠NDS評(píng)分、腦組織水分含量、血腫周圍腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)較低，且延遲低溫組和右美托咪定組均高于右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組，表明延遲低溫治療聯(lián)合右美托咪定能夠更有效地抑制大鼠腦出血后繼發(fā)的血腫周圍腦水腫，減少腦細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)功能缺損程度，有利于預(yù)后的改善。

腦出血后釋放的炎癥細(xì)胞因子在繼發(fā)性腦水腫的發(fā)生過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。TNF-α為炎癥反應(yīng)中的神經(jīng)毒介質(zhì)，由多種細(xì)胞分泌，其水平與血腫周圍水腫體積呈正相關(guān)性，可預(yù)測(cè)水腫嚴(yán)重程度[15]，還能誘導(dǎo)趨化因子釋放；IL-8屬于中性粒細(xì)胞趨化因子，可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集、黏附，引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，刺激氧自由基等有害介質(zhì)釋放，使得神經(jīng)細(xì)胞和血腦屏障受損，誘發(fā)腦組織水腫。本研究顯示，與模型組比較，各組大鼠血清TNF-α、IL-8水平較低，且延遲低溫組、右美托咪定組均高于右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組，表明左美托咪定能協(xié)助延遲低溫治療降低腦出血大鼠血清炎癥細(xì)胞因子水平，減輕腦出血誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，緩解炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的腦水腫和組織損傷。

神經(jīng)元損傷是腦出血后神經(jīng)功能缺損的根本原因。NSE主要存在于中樞神經(jīng)元胞漿內(nèi)、能夠起到營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元及神經(jīng)保護(hù)作用，神經(jīng)元受損時(shí)，NSE被釋放，經(jīng)血腦屏障進(jìn)入血液，導(dǎo)致其血液含量增加，血液NSE水平與腦出血的出血量正相關(guān)，可用來(lái)評(píng)價(jià)腦損傷程度及預(yù)測(cè)預(yù)后[16]。S100β也是神經(jīng)生化標(biāo)志物，由活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，參與神經(jīng)元生長(zhǎng)、再生、修復(fù)過(guò)程，血中S100β過(guò)多可加重腦水腫，其血清水平升高也與神經(jīng)元損傷有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，各組大鼠血清NSE、S100β水平較低，且延遲低溫組和右美托咪定組均高于右美托咪定聯(lián)合延遲低溫組，表明右美托咪定能提高延遲低溫治療對(duì)腦出血大鼠腦組織的保護(hù)作用，有效減輕腦損傷程度。

綜上所述，右美托咪定能夠提高延遲低溫治療對(duì)大鼠腦出血的治療效果，有效改善神經(jīng)功能缺損，減輕腦組織水腫，抑制腦細(xì)胞凋亡，減輕相關(guān)炎癥反應(yīng)和腦損傷程度。