葡萄籽原花青素抑制人骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖的機(jī)制研究*

于長(zhǎng)水徐佳元 王春雷 陶學(xué)強(qiáng)

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院骨科，哈爾濱150001）

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是一種原發(fā)性骨骼惡性腫瘤，其組織學(xué)特征是間充質(zhì)來(lái)源的梭形細(xì)胞沉積未成熟的類骨質(zhì)基質(zhì)[1]。OS的美國(guó)年發(fā)病率為0.0031‰，是兒童骨骼中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤[2]，具有極高的轉(zhuǎn)移潛能。目前，新輔助化療聯(lián)合根治性手術(shù)可將OS的5年生存率提高至70%[3]，但化療藥物也帶來(lái)了諸如骨髓抑制、肝腎功能損害等副作用，嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量[4]。故臨床上迫切需要新型的高效低副作用的抗OS藥物。原花青素（proanthocyanidin,PC）是植物中廣泛存在的一類多酚化合物的總稱，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成，屬于生物類黃酮，具有提高免疫、減輕機(jī)體損傷、抗氧化和抗炎等活性，且毒性更低[5-7]。1961首次從山楂新鮮果實(shí)的提取物中分離得到PC，后又相繼在葡萄、花生、大黃、銀杏等植物中發(fā)現(xiàn)，其中以葡萄籽和松樹皮中含量最高。最新研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽PC能夠抑制包括肺癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，但其對(duì)于OS MG63細(xì)胞的作用及機(jī)制尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道[8-10]。本研究旨在探討葡萄籽PC對(duì)OS MG63細(xì)胞的增殖抑制以及對(duì)其細(xì)胞周期的阻滯，為葡萄籽PC作為潛在的治療OS藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

人OS細(xì)胞株MG63（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），葡萄籽PC（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞950 g/L，廣東方晟公司），胎牛血清、胰蛋白酶、100×青/鏈霉素、高糖DMEM培養(yǎng)基（Gbico，美國(guó)），MTT（Promega，美國(guó)），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（BD，美國(guó)），一抗稀釋液、二抗稀釋液（碧云天，中國(guó)），PVDF膜（Millipore，美國(guó)），發(fā)光液（Thermo scientific，美國(guó)），一抗兔抗人 cyclinA、cyclinB1、CDK1、CDK2、p21、p27（Cell Signaling Technology，美國(guó)），辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗羊抗兔（Santa Cruz，美國(guó)），蛋白免疫印跡以及明膠酶譜相關(guān)試劑（碧云天，中國(guó)），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組：取液氮保存OS MG63細(xì)胞復(fù)蘇，用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，于37°C、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增殖期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照培養(yǎng)基中加入不同濃度的葡萄籽PC分為4個(gè)組，分別為空白對(duì)照組、30 μg/ml葡萄籽PC組、60 μg/ml葡萄籽PC組和90 μg/ml葡萄籽PC組。

1.2.2 MTT法測(cè)MG63細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG63細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化單層MG63細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，以每孔6×103個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化。各組細(xì)胞加入不同濃度的葡萄籽 PC（0 μg/ml、30 μg/ml、60 μg/ml、90 μg/ml），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，2個(gè)不加細(xì)胞的空白孔。細(xì)胞在各自條件下培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入MTT液20 μl，37℃下繼續(xù)孵育4～6 h，小心棄去培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO）溶液，振蕩10 min，選擇492 nm波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光密度（optical density,OD）值并記錄。以時(shí)間為橫軸，吸光值為縱軸繪制MG63細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 碘化丙啶（propidium iodide,PI）單染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞亞二倍體百分率和細(xì)胞周期：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MG63細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105/ml，接種于6孔板，總體積1 ml。12 h后分別加入質(zhì)量濃度為0 μg/ml，30 μg/ml，60 μg/ml，90 μg/ml的葡萄籽PC培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，消化收集細(xì)胞，離心速率1000 r/min，離心6 min后棄去上清。用預(yù)冷濃度為0.01 mol/L的PBS液重懸細(xì)胞，離心、洗滌2次，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇4℃固定過(guò)夜。上機(jī)前用預(yù)冷的PBS液洗滌3次后，加入PI染色液（含RNA酶），終質(zhì)量濃度5.0×10-2g/L，避光染色30 min，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量的變化，每個(gè)樣本隨機(jī)分析10000個(gè)細(xì)胞。

1.2.4 Western印跡法測(cè)定MG63細(xì)胞中各蛋白的表達(dá)：用含60 μg/ml的葡萄籽PC處理MG63細(xì)胞48 h后，裂解MG63細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量蛋白含量，等量樣品以體積分?jǐn)?shù)12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)。切膠轉(zhuǎn)膜，體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉封閉后，加入一抗，4°C孵育過(guò)夜，次日洗膜后加入二抗，37°C孵育1 h，洗后顯影采集圖像，用Quantity One軟件分析灰度值，用以β-actin或histone為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同處理組的差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 葡萄籽PC對(duì)MG63細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示，在同一時(shí)間點(diǎn)，MG63細(xì)胞的生長(zhǎng)情況隨葡萄籽PC濃度增加而影響增大；在葡萄籽PC濃度相同的情況下，MG63細(xì)胞的生長(zhǎng)情況隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而影響增大；葡萄籽PC呈濃度和時(shí)間依賴性抑制MG63細(xì)胞增殖（表1）。

表1 MTT法檢測(cè)不同濃度及時(shí)間條件下葡萄籽PC對(duì)MG63細(xì)胞增殖的影響（±s，%）

表1 MTT法檢測(cè)不同濃度及時(shí)間條件下葡萄籽PC對(duì)MG63細(xì)胞增殖的影響（±s，%）

注：△與0 μg/ml組比較，P＜0.05；▲與0 μg/ml組比較，P＜0.01

72 h 100 71.8±8.3▲65.7±5.5▲32.8±2.9▲GSP濃度0 μg/ml 30 μg/ml 60 μg/ml 90 μg/ml 24 h 100 89.6±6.8△71.7±10.8▲47.6±7.4▲48 h 100 79.8±4.5▲68.5±4.2▲41.6±3.3▲

2.2 葡萄籽PC對(duì)MG63細(xì)胞周期的影響

PI單染色流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，葡萄籽PC誘導(dǎo)MG63細(xì)胞G2/M期和S期阻滯，用不同濃度的葡萄籽PC分別處理MG63細(xì)胞48 h后，收集并固定細(xì)胞以檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果顯示，與同期空白對(duì)照組相比，各個(gè)葡萄籽PC處理組的細(xì)胞S期比例上升，G2/M的比例上升，而G0/G1期比例下降，且以上數(shù)據(jù)變化具有葡萄籽PC濃度依賴性（表2）。

2.3 Western印跡結(jié)果

使用不同濃度的葡萄籽PC處理MG63細(xì)胞48 h后使用Western印跡檢測(cè)其cyclin A、cyclinB1、CDK1、CDK2、p21和p27表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示以與G2/M期進(jìn)展相關(guān)的cyclinB1和CDK1表達(dá)水平隨著葡萄籽PC濃度的升高而升高，與S期進(jìn)展有關(guān)的CDK2和cyclinA的表達(dá)水平隨著葡萄籽PC濃度的升高而升高，與腫瘤增殖抑制作用相關(guān)的p21、p27表達(dá)水平同樣隨著葡萄籽PC濃度的升高而升高（圖1）。

表2 葡萄籽PC處理MG63細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期各階段分布比例（±s，%）

表2 葡萄籽PC處理MG63細(xì)胞48 h后細(xì)胞周期各階段分布比例（±s，%）

注：△與0 μg/ml組比較，P＜0.05；▲與0 μg/ml組比較，P＜0.01

G2/M期33.4±2.5 36.9±4.4 39.1±7.3 44.3±2.0▲GSP濃度0 μg/ml 30 μg/ml 60 μg/ml 90 μg/ml G0/G1期59.5±6.8 54.3±6.1 46.2±3.2△30.1±6.4▲S期7.2±1.2 8.8±1.2△14.8±2.4▲25.6±2.9▲

圖1 Western印跡法檢測(cè)不同濃度GSP處理MG63細(xì)胞48 h后 cyclinA、cyclinB1、CDK1、CDK2、p21、p27 的表達(dá)水平

3 討論

OS是來(lái)源于間葉組織的兒童和青少年最為常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，具有高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性、高致死率等特點(diǎn)[11,12]。目前，臨床上對(duì)于OS的治療方法以新輔助化療聯(lián)合根治性手術(shù)治療為主，雖然化療提高了患者的5年生存率，但是化療藥物均具有較高的毒副作用，對(duì)于患者的肝、腎、血液體統(tǒng)等均會(huì)造成較大的損害；此外，化療所需的周期較長(zhǎng)，在增加患者痛苦的同時(shí)也增加了OS細(xì)胞的耐藥性，使化療效果大打折扣，最終導(dǎo)致長(zhǎng)期生存率降低[13,14]。因此，開發(fā)高效低副作用的新型化療藥物對(duì)于提高OS患者的治愈率、生存率具有重要意義[4]。

PC是一類廣泛存在于自然界中的一大類聚多酚類化合物，其在酸性介質(zhì)中受熱可轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄇ嗨?；其廣泛分布在植物中，尤以葡萄籽中含量最高，葡萄籽中PC的提取量可達(dá)2.05%[15]。葡萄籽PC是由不同數(shù)量的兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子酸及沒(méi)食子酸酯等結(jié)合而成的單體或多聚體[16]。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽PC具有抗炎、抗氧化、預(yù)防和減輕化療損傷的作用，且毒副作用小、生物利用度較高[17]。越來(lái)越多的學(xué)者開始關(guān)注葡萄籽PC的抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽PC對(duì)肺癌、前列腺癌、乳腺癌、直腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的抑制增殖和促進(jìn)凋亡的作用[9,15,18,19]。Fishman等[20]研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽PC可以通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控因子cyclinE、CDK2和CDK4，引起G0/G1周期阻滯，從而抑制人膀胱癌T24細(xì)胞生長(zhǎng)。Prasad等[21]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽PC能夠通過(guò)將胰腺癌細(xì)胞阻滯在G2/M期，從而降低胰腺癌細(xì)胞的增殖。謝佳卿等[22]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽PC引起G0/G1周期阻滯和周期相關(guān)蛋白cyclinD1下調(diào)，還使細(xì)胞凋亡率明顯增高，并認(rèn)為其涉及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制。迄今為止，葡萄籽PC在人OS MG63細(xì)胞株中的作用尚無(wú)報(bào)道。本研究采用不同濃度葡萄籽PC處理人OS MG63細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同濃度葡萄籽PC均能夠抑制OS MG63細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴性；此外還發(fā)現(xiàn)，葡萄籽PC可以將MG63細(xì)胞阻滯在G2/M期和S期，提示葡萄籽PC具有成為治療OS新藥的潛力。

本研究?jī)H通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)MG63細(xì)胞系進(jìn)行了細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期阻滯方面的研究，尚不能深刻理解葡萄籽PC抗OS的復(fù)雜過(guò)程。今后將利用包括人類OS細(xì)胞株143B、SAOS-2等進(jìn)行更加深入的研究。

綜上，葡萄籽PC可抑制OS MG63細(xì)胞的增殖，這種抑制作用呈濃度和時(shí)間雙重依賴性；葡萄籽PC以時(shí)間依賴性方式顯著下調(diào)了與G2/M期進(jìn)展相關(guān)的cyclinB1和CDK1，顯著上調(diào)了細(xì)胞周期抑制蛋白p21、p27；證實(shí)葡萄籽PC對(duì)于OS MG63細(xì)胞增殖的抑制作用是通過(guò)將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期而實(shí)現(xiàn)的。本研究為葡萄籽PC成為潛在的抗OS藥物、闡明葡萄籽PC抑制OS的分子機(jī)制和將G2/M期作為OS潛在靶點(diǎn)提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。