化妝品中貝美格及其鹽類的高效液相色譜檢測及質(zhì)譜確證

郭項(xiàng)雨，呂悅廣,2，陳 萌,3，王 春,4，孟憲雙，白 樺，馬 強(qiáng)

（1． 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2． 中國科學(xué)院大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，北京 101407；3． 北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；4． 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

近年來，隨著生活節(jié)奏的加快和社會(huì)壓力的增加，人們的睡眠質(zhì)量普遍下降[1]，進(jìn)而導(dǎo)致在日常生活及工作中精神不夠飽滿，具有清爽、醒膚功能的化妝品越來越受到消費(fèi)者的關(guān)注及青睞。3-乙基-3-甲基戊二酰亞胺（CAS 64-65-3）又稱貝美格，英文名bemegride，貝美格及其鹽作為一種中樞興奮劑，具有增強(qiáng)呼吸及興奮作用[2]，在醫(yī)學(xué)上具有廣泛的研究及應(yīng)用[3-5]，但貝美格及其鹽具有遲發(fā)毒性，會(huì)引起情緒不安，精神錯(cuò)亂、幻覺幻視等癥狀，添加在化妝品中會(huì)對(duì)人體健康造成潛在危害，我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）中明確規(guī)定化妝品中不得添加貝美格及其鹽[6]。

目前針對(duì)化妝品中禁用成分的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[7-9]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLCMS）[10-13]、氣相色譜法（GC）[14,15]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[16,17]、 超臨界流體色譜法（SFC）[18]及一些新型的快檢方法，如離子遷移譜法（IMS）[19.20]、原位電離質(zhì)譜法（AIMS）[21]等。上述化妝品檢測方法涉及《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）中的禁用防腐劑、塑化劑、防曬劑、芳香劑及糖皮質(zhì)激素等物質(zhì)的測定，但尚未見化妝品中貝美格及其鹽類的測定方法報(bào)道。本研究開發(fā)建立了化妝品中貝美格及其鹽類的測定方法，對(duì)于確?；瘖y品質(zhì)量安全和消費(fèi)者健康安全具有積極意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；ACQUITY超高效液相色譜儀、Xevo TQ MS三重四極桿質(zhì)譜儀、MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Waters公司）；Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）；KQ-600B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CR 21G型高速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）。

貝美格（CAS 64-65-3，純度≥98%），德國Dr.Ehrenstorfe公司；甲醇和乙腈，色譜純，美國Fisher公司；其他試劑均為分析純。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取貝美格標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)需要用甲醇稀釋成適用濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1 g樣品（水劑類和洗面奶類直接稱取，乳液類樣品需加入2 g氯化鈉）于10 mL具塞離心管中，加入甲醇至刻度，超聲輔助提取20 min，以8 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后供高效液相色譜測定。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（50∶50, V∶V），等度洗脫；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm。貝美格及其鹽類標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 貝美格及其鹽類標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of bemegride and its salts

1.5 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證條件

色譜條件：XBridge C18（2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：乙腈（A）和0.3%氨水溶液（B），等度洗脫（20∶80, V∶V）；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；萃取錐孔電壓：3.0 V；離子源溫度：150 ℃，脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/h，錐孔氣流量：50 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 貝美格及其鹽類的質(zhì)譜分析參數(shù)Tab.1 Op timized MS/MS parameters for the analysis of bemegride and its salts

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

測定貝美格及其鹽類的最大紫外吸收波長，設(shè)定掃描范圍為200 ～ 400 nm。經(jīng)測定，貝美格在210 nm處有最大吸收，因此設(shè)定它們的最大吸收波長為210 nm，貝美格標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外吸收光譜圖見圖2。

圖2 貝美格標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外吸收光譜圖Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of bemegride

2.2 色譜柱的優(yōu)化

分 別考察了不同品牌、不同鍵合相的色譜柱對(duì)貝美格及其鹽類保留行為，如Eclipse XDB C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）、XTerra MS C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）、Promosil C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）、Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）和Kromasil C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）。結(jié)果表明，選擇不同C18色譜柱對(duì)貝美格及其鹽類的色譜行為無明顯差異，因此選擇通用型C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）高效液相色譜柱均可，本方法選擇Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm, 5 μm）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

分別選擇甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相，比較不同流動(dòng)相對(duì)貝美格及其鹽類色譜行為的影響。結(jié)果表明，采用甲醇-水作為流動(dòng)相，貝美格的色譜峰峰型較好。在此基礎(chǔ)上，考察甲醇與水體積比為40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40時(shí)對(duì)貝美格及其鹽類的色譜保留時(shí)間的影響。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇比例大于50%時(shí)，貝美格及其鹽類保留時(shí)間較弱，導(dǎo)致在實(shí)際檢測中發(fā)生嚴(yán)重的基質(zhì)干擾現(xiàn)象。因此流動(dòng)相最終優(yōu)化結(jié)果為V（甲醇）∶V（水）=50∶50。

2.4 柱溫的優(yōu)化

分別選擇柱溫為25 ，30 ，35 ℃，考察色譜柱溫度對(duì)貝美格及其鹽類的影響。結(jié)果表明，在各溫度下貝美格的色譜行為無明顯差異。根據(jù)不同地區(qū)氣候差異及各實(shí)驗(yàn)室條件的不同，柱溫設(shè)定為30 ℃。

2.5 提取溶劑的選擇

比較甲醇和乙腈對(duì)貝美格及其鹽類提取效果的影響。篩選經(jīng)測定不含貝美格及其鹽類的水劑類、洗面奶類和乳液類樣品作為空白樣品，向其中加入一定量貝美格標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻后進(jìn)行提取。結(jié)果表明，用甲醇或乙腈進(jìn)行提取，平行6次實(shí)驗(yàn)，兩者提取率均可達(dá)到95%，提取效果無明顯差異?？紤]到乙腈毒性較大，成本較高，選擇甲醇為提取溶劑。

2.6 質(zhì)譜確證

由于化妝品配方中成分較多，基質(zhì)復(fù)雜，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有更好的特異性和抗干擾能力，因此進(jìn)一步開發(fā)了貝美格及其鹽類的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法。樣品經(jīng)高效液相色譜法分析后，若疑似陽性樣品，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法加以確證。在1.5確證條件下，經(jīng)提取離子后，若出現(xiàn)154.2＞112.1和154.2＞138.1兩對(duì)離子對(duì)，并且離子對(duì)間相對(duì)豐度允許偏差在20%內(nèi)，可確證樣品中含有貝美格。貝美格及其鹽類的質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 貝美格及其鹽類標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜圖Fig.3 MRM chromatogram of bemegride and its salts

2.7 方法的線性范圍、檢出限和定量限

在本方法實(shí)驗(yàn)條件下，貝美格及其鹽類的測定結(jié)果均以貝美格測定值計(jì)算。配制1 000 mg/L 的貝美格標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，甲醇將其稀釋至0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg/L不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液；以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)貝美格濃度為橫坐標(biāo)作圖，在以上濃度范圍內(nèi)，貝美格及其鹽類線性方程為y=41.52x + 2.387，相關(guān)系數(shù)r2=0.999，呈良好的線性關(guān)系。以信噪比為3估算方法的檢出限（LOD），以信噪比為10估算方法的定量限（LOQ），貝美格的檢出限為0.2 mg/kg，定量限為0.5 mg/kg。

2.8 方法的回收率與精密度

分別稱取經(jīng)測定不含貝美格及其鹽類的化妝品作為空白樣品，設(shè)定了0.5 mg/kg、5 mg/kg、50 mg/kg 3個(gè)添加濃度。待測樣液中貝美格及其鹽類含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線之內(nèi)，超出線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)行分析。按本檢驗(yàn)方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)每個(gè)添加濃度對(duì)水劑類、膏霜類和乳液類樣品進(jìn)行了6次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可知，回收率為 85.1% ～107.4%，精密度實(shí)驗(yàn)測得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.7% ～ 9.3%?？瞻讟悠诽砑迂惷栏駱?biāo)準(zhǔn)溶液高效液相色譜圖見圖4。由圖4可知，所選空白樣品中的雜質(zhì)不會(huì)對(duì)貝美格分離分析造成干擾。

表2 貝美格及其鹽的平均回收率及精密度結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of recovery and precision for bemegride and its salts (n=6)

圖4 空白樣品添加貝美格標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of blank sample spiked with bemegride

2.9 實(shí)際樣品的測定

按照本研究建立的方法對(duì)市售、網(wǎng)購等多種途徑獲取的26件化妝品樣品進(jìn)行了測定，其中水劑類樣品8件，洗面奶類樣品10件，乳液類樣品8件。結(jié)果表明，所測化妝品樣品中均未檢出貝美格及其鹽類。

3 結(jié)論

本研究建立了測定化妝品中貝美格及其鹽類的高效液相色譜檢測方法及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法。該方法準(zhǔn)確、快速、靈敏度高，適用于化妝品中貝美格及其鹽類的測定。