分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹研究中的應(yīng)用與前景展望

王占營(yíng) 冀含樂 王二強(qiáng)

摘? 要：該文綜述了牡丹研究中分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用的主要內(nèi)容和進(jìn)展，主要包括牡丹遺傳多樣性分析，指紋圖譜構(gòu)建，早期雜種鑒定和基因定位等方面的應(yīng)用。并且分析了此研究領(lǐng)域目前存在的問題，展望了牡丹分子育種的前景。

關(guān)鍵詞：分子標(biāo)記技術(shù);牡丹;應(yīng)用與前景展望

中圖分類號(hào) S685.11文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）（02-03）-0010-03

Abstract：The main contents and progress of molecular technology in peony research are reviewed in this paper.The main applications include molecular marker technology in peony genetic diversity analysis，fingerprint mapping construction，early hybrid identification and gene mapping.The current problems in this research field are pointed out，and the application of peony molecular breeding is prospected.

Key words：Molecular marker technology;Peony;Application and prospects

1 引言

分子標(biāo)記是基于核酸分子多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，其直接反映了脫氧核糖核酸（DNA）分子水平的遺傳變異。相對(duì)于傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記，如形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記，分子標(biāo)記具有許多優(yōu)點(diǎn)，如標(biāo)記的數(shù)量多，多態(tài)性高，分布廣，中性，無環(huán)境限制等[1-2]。DNA分子標(biāo)記及其相關(guān)的主要分子技術(shù)有：（1）基于Southern雜交的標(biāo)記，如 RFLP、SSCP-RFLP和DGGE-RFLP;（2）基于PCR的標(biāo)記，如RAPD、AFLP、TRAP、SPAR等;（3）基于重復(fù)序列的標(biāo)記，如SSR、SSLP、微衛(wèi)星DNA等;（4）mRNA為基礎(chǔ)的標(biāo)記，如RT-PCR、EST、SAGE等;（5）單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的標(biāo)記，如SNP[3]。牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.），為芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia L.）落葉灌木，是中國(guó)的傳統(tǒng)名花[4]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)牡丹的研究，除了傳統(tǒng)的育種改良，各種牡丹生物學(xué)特性和栽培種植等之外，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和廣泛運(yùn)用，利用分子技術(shù)的牡丹遺傳多樣性分析、指紋圖譜分析、早期雜種鑒定和基因定位等研究工作也逐步深入。本文簡(jiǎn)述了當(dāng)前分子標(biāo)記在牡丹各方面的研究進(jìn)展。

2 分子標(biāo)記技術(shù)在牡丹研究中的應(yīng)用

2.1 遺傳多樣性分析 中國(guó)牡丹資源豐富，種類繁多，研究分析牡丹遺傳背景對(duì)牡丹資源保護(hù)和雜交育種工作具有重要意義。1994年，裴顏龍等利用10對(duì)隨機(jī)引物擴(kuò)增出了矮牡丹和紫斑牡丹的基因組DNA，DNA條帶的多態(tài)性反應(yīng)出了牡丹種群間和種群內(nèi)的遺傳差異，證實(shí)了RAPD技術(shù)可用于牡丹遺傳多樣性分析[5]。隨后，研究人員分別利用RAPD、AFLP和SRAP等分子標(biāo)記技術(shù)分析了不同花色、不同株高和不同花型的牡丹品種的基因組DNA多態(tài)性，研究牡丹品種之間的親緣關(guān)系[6-8]。李保印等將牡丹的農(nóng)藝表型性狀與2種分子標(biāo)記ISSR、AFLP結(jié)合起來，構(gòu)建了中原牡丹品種核心種質(zhì)資源庫(kù)[9]。之后，研究者們分別利用ISSR、SSR、SRAP、CDDP標(biāo)記方法分析滇牡丹、紫斑牡丹、大花黃牡丹、菏澤牡丹和不同牡丹品種群的遺傳多樣性[10-15]，為牡丹品種資源保護(hù)、利用以及新品種選育提供分子生物學(xué)依據(jù)。綜上所述，利用分子標(biāo)記技術(shù)研究牡丹的遺傳多樣性，主要體現(xiàn)在親緣關(guān)系分析、核心種質(zhì)庫(kù)構(gòu)建、野生資源評(píng)價(jià)和品種起源等方面。

2.2 指紋圖譜的構(gòu)建 目前牡丹栽培品種有2000多種，不同品種的從形態(tài)上鑒別非常困難，因?yàn)橛械钠贩N直接差異非常小，而且開花情況還受到地理、氣候等影響，同一品種不同環(huán)境下表現(xiàn)也不完全一致。而利用分子標(biāo)記技術(shù)來鑒定品種可以避開這些問題。以DNA分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的DNA電泳圖譜能夠鑒別生物個(gè)體之間的差異，在鑒定品種中具有高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)[16]。因其如同人類指紋一樣識(shí)別不同的牡丹品種，也稱指紋圖譜。已有研究者通過構(gòu)建牡丹品種的指紋圖譜來鑒定識(shí)別不同的牡丹品種，其中包括不同牡丹品種群和芍藥品種。其中用到的分子標(biāo)記有熒光AFLP分子標(biāo)記、SRAP、EST-SSR和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)等[17-21]?；诜肿訕?biāo)記技術(shù)的DNA指紋圖譜，彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)分類的缺陷，可有效地推動(dòng)牡丹品種的鑒定和保護(hù)。

2.3 雜種早期鑒定 牡丹屬于落葉灌木，從1粒種子到穩(wěn)定開花至少需要3～4年的時(shí)間，雜交育種周期很長(zhǎng)，并且雜交后存在真假雜交種子的問題，這是傳統(tǒng)的雜交育種面臨的問題。而利用分子標(biāo)記技術(shù)，使雜種的早期鑒定和分子輔助育種成為可能。目前，SRAP、AFLP、SSR等標(biāo)記技術(shù)已用于牡丹雜交種的早期鑒定以及雜交后代與親本間的遺傳關(guān)系[22-27]。這些研究，充分證明了分子標(biāo)記技術(shù)在雜交鑒定中的可靠性和優(yōu)越性。

2.4 基因定位 觀賞牡丹新品種的選育點(diǎn)在花期，牡丹花期短暫，單朵花期約7～10d，群體花期集中，非常不利于牡丹觀賞以及整個(gè)牡丹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，觀賞牡丹的育種方向重點(diǎn)在花色、花期、鮮切花壽命的改良調(diào)控。乙烯是影響器官衰老的重要生理因素，其對(duì)延長(zhǎng)牡丹花期和鮮切花的壽命非常重要[28]，目前通過克隆合成乙烯的關(guān)鍵酶（ACC氧化酶）基因的部分序列，構(gòu)建該基因的反義載體可以抑制乙烯的合成[29]。利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆牡丹鮮切花花瓣中ACO基因，序列分析表明，ACO基因?qū)δ档で谢ǖ拈_放衰老具有調(diào)節(jié)作用[30]。另外，有研究人員采用RT-PCR技術(shù)，克隆出2個(gè)控制牡丹長(zhǎng)日照途徑誘導(dǎo)成花的關(guān)鍵基因PsCO、PsFT 以及1個(gè)PsFT的下游調(diào)控基因PsSOC1[31]。2015年，蔡長(zhǎng)福利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)SLAP-seq（Specific-locus amplified fragment sequencing）和簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建牡丹高密度遺傳連鎖圖譜，定位牡丹重要表型性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative trait loci，QTLs）[32]。周華利用分子生物學(xué)方法分析比較二次開花和一次開花牡丹成花過程中與開花時(shí)間相關(guān)基因的表達(dá)差異[33]。2018年，侯小改等利用轉(zhuǎn)錄組BSA關(guān)聯(lián)分析，定位到牡丹花期控制基因[34]。這一系列牡丹相關(guān)基因的定位，為未來利用分子手段改良牡丹性狀奠定了基礎(chǔ)。

3 問題與展望

3.1 問題 分子標(biāo)記技術(shù)已逐漸應(yīng)用于牡丹品種的遺傳多樣性研究、指紋圖譜構(gòu)建和品種鑒定等方面。目前存在的問題是：一是分子標(biāo)記成本普遍較高，隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，需要大幅度降低測(cè)序成本;二是當(dāng)前牡丹分子生物學(xué)的研究基礎(chǔ)仍相對(duì)薄弱，需要更多的研究人員共同努力以推進(jìn)牡丹分子研究，為牡丹資源保護(hù)，品種改良和新品種培育打好基礎(chǔ);三是我國(guó)牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)還不夠成熟，在牡丹組培苗生根和移栽方面仍存在一定的問題。這些都是牡丹分子育種中的難點(diǎn)，嚴(yán)重阻礙了牡丹分子育種進(jìn)程，同時(shí)也是目前牡丹分子育種的瓶頸，尚需研究人員共同努力克服，以加快牡丹分子育種進(jìn)程。

3.2 展望 （1）分子標(biāo)記輔助育種：通過牡丹全基因組測(cè)序獲得一些重要經(jīng)濟(jì)性狀的分子標(biāo)記，對(duì)牡丹雜交育種后代中目的基因進(jìn)行定向選擇，加速牡丹新品種選育進(jìn)程。（2）轉(zhuǎn)基因育種：成熟的組培技術(shù)是轉(zhuǎn)基因育種的基本，通過功能驗(yàn)證的目的靶基因，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化到牡丹愈傷組織中，經(jīng)過組織再生體系，可在短時(shí)間內(nèi)獲得優(yōu)良的花型、花色、花期以及抗性等重要農(nóng)藝性狀，縮短育種時(shí)間。（3）分子設(shè)計(jì)育種：利用牡丹全基因組圖譜，基于基因編輯技術(shù)，對(duì)目標(biāo)基因的進(jìn)行定點(diǎn)突變，實(shí)現(xiàn)牡丹重要農(nóng)藝性狀的分子設(shè)計(jì)及新品種培育，對(duì)未來的牡丹育種研究將起到極大的推動(dòng)作用。

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（責(zé)編：張宏民）