貓爪草非藥用部位抗氧化活性及成分研究

劉紅云 扶勝蘭 喬新榮 張艷玲

摘? 要：研究貓爪草地上部和種子的體外抗氧化活性和成分含量，為充分利用貓爪草資源提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，貓爪草地上部和種子的水提液具有一定的清除DPPH自由基、ABTS自由基活性及總還原能力。清除DPPH自由基的IC50值，地上部為0.57mg/mL，種子為4.95mg/mL;清除ABTS自由基的IC50值，地上部為0.614mg/mL、種子為1.06mg/mL。地上部的多糖含量（48.94mg/g）高于種子的（37.72mg/g），種子的蛋白質(zhì)含量（14.48mg/g）高于地上部的（3.59mg/g）。貓爪草非藥用部位具有一定的抗氧化活性，且地上部的抗氧化活性高于種子，這與地上部的多糖含量較高有關(guān)。

關(guān)鍵詞：貓爪草;地上部;種子;水提液;抗氧化;成分

中圖分類號(hào) R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）（02-03）-0012-04

Abstract：The antioxidant activity and main components on aerial parts and seeds of Ranunculus ternatus Thunb were studied for the aim to provide the theoretical basis for further development and utilization of its non-medicinal resources.The results indicated that the water extracts from the aerial parts and seeds of Ranunculus ternatus Thunb showed certain activity of scavenging DPPH radical，ABTS radical and the reducing power.The IC50 value of DPPH scavenging activity was 0.57mg/mL in the aerial parts of Ranunculus ternatus Thunb，and 4.95mg/mL in its seeds.The IC50 values of ABTS scavenging activity were 0.614mg/mL，1.06mg/mL respectively.The polysaccharide content was 48.94mg/g in the aerial parts of Ranunculus ternatus Thunb and 37.72mg/g in its seeds.Conversely，the proteins contents of aerial parts in Ranunculus ternatus Thunb was 3.59mg/g，lower than the seeds（14.48mg/g）.Consequently，the non-medicinal parts of Ranunculus ternatus Thunb showed certain antioxidant activity，and its becoming strength with the increase of water extracts concentractions of Ranunculus ternatus Thunb.The higher antioxidant activity of aerial parts of Ranunculus ternatus Thunb was related to its higher polysaccharide content.

Key words：Ranunculus ternatu;the aerial parts;Seeds;Water extracts;Antioxidant activity;Components

貓爪草（Radix Ranunculi Ternati）系毛茛科植物小毛茛（Ranunculus ternatus Thunb.）的干燥塊根，別名三散草、鴨腳板、金花草，主產(chǎn)于河南信陽(yáng)地區(qū)，在我國(guó)其他地區(qū)也有分布[1]。其名始見于《中藥材手冊(cè)》，《中國(guó)藥典》1995年將其收載。貓爪草性味甘、辛，性平，歸肝、肺經(jīng)，具有清熱解毒、軟堅(jiān)化痰、散結(jié)消腫、截瘧的功能[2]，主要用于治療瘰疬痰咳，疔瘡腫毒，蛇蟲炎等癥[3，4]。有研究表明，貓爪草多糖為其主要活性成分[5，6]，具有重要的生物活性[6，7]，尤其是體外抗氧化活性[8]。目前，對(duì)貓爪草的研究主要集中在塊根部位，也有研究表明貓爪草全草均可入藥[9]。本研究以貓爪草地上部分和種子為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其水提液體外抗氧化活性和成分進(jìn)行了測(cè)定分析，旨在為充分利用貓爪草資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 貓爪草地上部（貓爪草塊根收獲期采集）和貓爪草種子（經(jīng)信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院周巍副教授鑒定），均于2016年5月采自河南省信陽(yáng)市淮濱縣王崗村貓爪草種植基地。去除雜質(zhì)，陰干，60℃鼓風(fēng)干燥至恒重，粉碎（80目）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 1，1-二苯基-2-三硝基苦肼（DPPH），購(gòu)自Wako;2，2-聯(lián)氨-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），購(gòu)自Sigma公司;石油醚（浙江中星化工試劑有限公司），無(wú)水乙醇（杭州龍山精細(xì)化工有限公司）;抗壞血酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、苯酚、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、冰乙酸、硫脲、鄰甲苯胺、考馬斯亮藍(lán)、牛血清蛋白等試劑，均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 儀器 JP-500B-2型多功能粉碎機(jī)（上海市久品工貿(mào)有限公司），DK-S24型恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），T6-紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司），CP225D型1/10萬(wàn)電子分析天平（德國(guó)SATORIO 公司），202-2A數(shù)顯電熱恒溫干燥箱（杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠），Direct-Q3超純水機(jī)（美國(guó)Milipore）等。

1.4 方法

1.4.1 樣品提取液的制備 精密稱取貓爪草地上部和種子粉末1.000g于圓底燒瓶中，加10倍量的石油醚（沸程60～90℃）回流提取2h，待殘?jiān)鼡]干溶劑后，加入150mL蒸餾水，于95℃下水浴回流提取2h、過(guò)濾，用熱蒸餾水潤(rùn)洗殘?jiān)ㄈ葜?00mL，得5mg/mL的水提液，然后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?.5mL樣品提取液于離心管中，2倍稀釋成0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5mg/mL 5種濃度的溶液，用于抗氧化活性的測(cè)定。將陽(yáng)性對(duì)照品Vc配制成5mg/mL母液，依據(jù)相應(yīng)測(cè)定項(xiàng)目稀釋至不同濃度。

1.4.2 DPPH自由基清除活性的測(cè)定 取不同濃度的樣品提取液及Vc陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品1mL加入3mLDPPH（0.1mmol/L）混勻后，37℃下靜置30min的，于517nm測(cè)其吸光值（OD517）[10]，記為As。同時(shí)測(cè)定1mL樣品提取液和Vc陽(yáng)性對(duì)照品加3mL無(wú)水乙醇測(cè)OD517，記為A0;無(wú)水乙醇加3mL DPPH的OD517，記為Ac。計(jì)算樣品和Vc陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)DPPH自由基的清除率。計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率（%）=[1-（AS-A0）/AC]×100

1.4.3 ABTS自由基清除率的測(cè)定[11] 稱取ABTS樣品20.3mg，溶于5mL的蒸餾水中，配制成7.4mmol/LABTS儲(chǔ)備液;稱取過(guò)硫酸鉀3.51mg，溶于5mL的蒸餾水中，配制成2.6mmol/L儲(chǔ)備液;混合之后，在室溫、避光條件下靜置12～16h。取1mL的混合液，加40mL的磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH6.6），使得在734nm下的吸光度為0.7±0.005。分別取不同濃度的樣品提取液和Vc1mL加入4mLABTS混勻后，室溫靜置5min后測(cè)定吸光值。清除率計(jì)算方法同1.4.1。

1.4.4 總還原能力的測(cè)定[12] 取不同濃度的樣品提取液2.5mL，加2.5mL磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH6.6）和2.5mL1%K3Fe（CN）6，50水浴保溫20min，快速冷卻后加入2.5mL的10%三氯乙酸，3000r/min離心10min，取上清液2.5mL加2.0mL蒸餾水、0.5mL的0.1%FeCI3，靜置10min，700nm測(cè)吸光值。吸光值越大，表示還原力越強(qiáng)。

1.4.5 樣品提取液成分含量測(cè)定[13]

1.4.5.1 多糖 采用O-T試劑法測(cè)定多糖含量。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制精密稱取干燥恒重的葡萄糖0.0502g，加蒸餾水定容到50mL。O-T試劑配制：250mL冰乙酸中加入0.4002g硫脲，15mL鄰甲苯胺混合，至硫脲完全溶解，加入飽和硼酸10mL，置棕色瓶中，室溫保存24h后使用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精取葡萄糖對(duì)照液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別于干燥具塞試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1.0mL，分別加入O-T試劑5.0mL，沸水浴30min，冷水冷卻，于630nm測(cè)吸光值A(chǔ)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.138027X+0.007673，R2=0.996，在0.2～1.0mg范圍內(nèi)線性良好。精取提取液各2.0mL，各加80%的乙醇8.0mL，靜置5min，離心吸取上清液，常壓過(guò)濾沉淀，再重復(fù)操作4次，揮干溶劑，殘?jiān)麴s水溶解，加活性炭攪勻脫色，抽濾，定容到10mL，稀釋1倍，從中各取1.0mL，裝入具塞試管中，加O-T試劑5mL，沸水浴30min，冷水冷卻，以試劑空白調(diào)0，測(cè)定630nm吸光度計(jì)算多糖含量。

1.4.5.2 蛋白質(zhì) 采取UV法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取5mg/mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.5、1.5、2.0、2.5和3mL于10mL的具塞刻度試管中，用重蒸水補(bǔ)齊至3mL，掃描紫外吸收光譜，測(cè)定280nm的吸光度（A），以質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=0.1129x+0.0025，R2=0.9996，n=6。吸取樣品提取液適量代替蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液3mL，活性炭脫色，測(cè)定280nm的吸光度計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.4.6 IC50的計(jì)算 IC50指自由基清除率為50%時(shí)樣品的濃度。以提取液濃度為自變量，清除率為因變量進(jìn)行曲線擬合，根據(jù)擬合方程計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 貓爪草地上部分和種子的水提液對(duì)DPPH自由基的清除率 抗氧化劑能夠清除DPPH自由基歸因于其提供質(zhì)子的能力。貓爪草地上部和種子的水提液能很好地清除DPPH自由基，且清除率隨質(zhì)量濃度的升高而增大。雖然在相同質(zhì)量濃度下，對(duì)DPPH自由基的清除率從小到大依次為：種子<地上部分地上部（0.57mg/mL）>種子4.95mg/mL。

2.2 貓爪草地上部和種子的水提液對(duì)ABTS自由基的清除能力 貓爪草地上部和種子的水提液具有一定的清除ABTS自由基能力，在供試樣品質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，貓爪草地上部對(duì)ABTS自由基的清除能力高于貓爪草種子水提液。貓爪草地上部和種子的水提液對(duì)ABTS自由基的IC50分別為0.614mg/mL和1.06mg/mL。

2.3 貓爪草地上部和種子的水提液的總還原能力 一種物質(zhì)的還原力大小可以反映其潛在抗氧化性能力。隨著質(zhì)量濃度的增大，貓爪草地上部和種子的水提液的總還原力逐漸增強(qiáng)，在相同質(zhì)量濃度下其還原力大小順序?yàn)椋篤c>地上部>種子。

2.4 貓爪草地上部和種子的水提液的成分含量 地上部多糖含量高于種子中的多糖含量，但是種子中含有較高的蛋白質(zhì)，為14.48mg/g;而貓爪草地上部蛋白質(zhì)含量?jī)H為3.59mg/g。

3 討論

3.1 貓爪草地上部和種子的水提液的抗氧化活性 藥用植物的采收過(guò)程是中藥材生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，也是實(shí)施中藥資源綜合利用的途徑之一。傳統(tǒng)中藥材在采收過(guò)程只取其某一部分，其余部分均廢棄，這不僅不利于中藥資源的綜合利用，還造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[14]。大量研究表明[15-18]：藥用植物的非藥用部位具有多種藥用成分和較強(qiáng)的生物活性，尤其是抗氧化活性。本研究結(jié)果表明，貓爪草地上部和種子的水提液均具有一定的抗氧化活性，且抗氧化能力與濃度相關(guān)。

3.2 貓爪草地上部和種子的水提液的成分含量 有研究表明，貓爪草多糖為貓爪草藥材主要活性成分[5，6]，不同產(chǎn)地貓爪草多糖含量差異顯著，其中以河南產(chǎn)貓爪草多糖含量較高[19]。貓爪草多糖具有較強(qiáng)的生物活性，如體外抗氧化[8]、抗腫瘤[7，20]、免疫調(diào)節(jié)[5，6]等。本研究結(jié)果顯示，貓爪草地上部和種子亦含有一定的多糖，貓爪草地上部為48.9mg/g，貓爪草種子為37.3mg/g。貓爪草多糖具有抗氧化活性，有一定的還原能力、較強(qiáng)的清除·OH和抑制O·的能力。貓爪草地上部的抗氧化活性高于種子，可能與貓爪草地上部的多糖含量較高有關(guān)。

4 結(jié)論

依據(jù)體外抗氧化活性和成分含量的測(cè)定結(jié)果，貓爪草地上部和種子的水提液均具有一定的抗氧化活性和活性成分。該研究結(jié)果可為充分利用貓爪草資源提供理論依據(jù)。

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（責(zé)編：張宏民）