脫落滋養(yǎng)層細(xì)胞在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用研究進(jìn)展*

李 丹 綜述，蘭風(fēng)華 審校

(廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院全軍檢驗醫(yī)學(xué)研究所臨床遺傳與實驗醫(yī)學(xué)科，福建福州 350025)

產(chǎn)前診斷是降低遺傳缺陷新生兒出生率最重要的方法，其金標(biāo)準(zhǔn)為羊膜腔穿刺獲取羊水中胎兒細(xì)胞行產(chǎn)前遺傳分析，但因其操作的有創(chuàng)性、致流產(chǎn)風(fēng)險和診斷時間位于孕中晚期等原因仍難以為廣大孕婦所接受。通過微創(chuàng)的方式獲得胎兒遺傳物質(zhì)及早期的產(chǎn)前診斷技術(shù)是該領(lǐng)域研究者追求的目標(biāo)。宮頸脫落滋養(yǎng)層細(xì)胞取材安全、便利，是產(chǎn)前診斷技術(shù)微創(chuàng)化的重要備選來源之一，且其可將診斷時間提早至5孕周[1]，即在現(xiàn)有的技術(shù)能檢測出胎兒是否患有先天性疾病之前，在微創(chuàng)性產(chǎn)前診斷領(lǐng)域展示出良好的應(yīng)用前景。

1 宮頸脫落滋養(yǎng)層細(xì)胞的獲取

孕早期宮頸脫落滋養(yǎng)層細(xì)胞的獲取方法有沖洗法(宮腔灌洗和宮頸灌洗)和直接獲取法(棉拭子、細(xì)胞刷取材法和宮頸黏液抽吸)，由于取材方法、孕期、懷孕狀態(tài)、操作者、檢測方法靈敏度等的不同，各研究宮頸滋養(yǎng)層細(xì)胞的獲取成功率在40%～90%[1]。

棉拭子和細(xì)胞刷取材法安全性最高，但最易受母體細(xì)胞和殘留精子及其遺傳物質(zhì)的影響，導(dǎo)致目標(biāo)細(xì)胞獲取成功率低，波動范圍大，結(jié)果可靠性低。國內(nèi)學(xué)者改良的套管拭子以及雙取器宮頸毛刷，更易于探入宮頸，取材污染程度相對較低，可將滋養(yǎng)層細(xì)胞的獲取成功率分別從原來的37.5%及40.0%提高至69.6%及77.8%[2-3]。宮頸黏液抽吸法為在超聲的定位下借助導(dǎo)管直接吸取宮頸黏液，滋養(yǎng)層細(xì)胞的獲取成功率為60.0%左右[4]。

沖洗法為向?qū)m腔下段或者宮頸管內(nèi)注射生理鹽水后立即回抽獲取宮頸黏液標(biāo)本的方法，該法獲取滋養(yǎng)層細(xì)胞成功率可達(dá)80%～90%[5]，是目前效率最高的方法。ERGIN等[6]在25例選擇終止妊娠的孕婦中進(jìn)行宮腔灌洗和宮頸灌洗的方法學(xué)比較發(fā)現(xiàn)，宮腔灌洗標(biāo)本目標(biāo)細(xì)胞獲取成功率及對胎兒性別的鑒定準(zhǔn)確性均高于宮頸灌洗標(biāo)本，但是兩者間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。沖洗法所獲標(biāo)本中可見血污染，甚至蛻膜碎片及絨毛碎片，表明該法具有一定的創(chuàng)傷性，且曾報道了1例在7～8孕周行宮腔灌洗的孕婦于38周時產(chǎn)下了四肢嚴(yán)重發(fā)育不全的胎兒[7]，以上表明雖然沖洗法目標(biāo)細(xì)胞獲取成功率高，診斷準(zhǔn)確性好，但是必須正視其侵入性質(zhì)以及對胎兒潛在的傷害，需要更多的研究對其安全性進(jìn)行評估。

2 脫落滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離

滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離是基于宮頸脫落滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行微創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的重要環(huán)節(jié)，所分離細(xì)胞的純度以及濃度直接影響診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。國內(nèi)外所用的方法主要有顯微操作法、激光捕獲顯微切割、免疫磁珠分離、流式細(xì)胞術(shù)以及差速貼壁培養(yǎng)富集法等。

顯微操作法操作簡單，在顯微鏡下直接將標(biāo)本中形態(tài)上具有滋養(yǎng)層組織和絨毛絲特征的細(xì)胞團(tuán)塊通過玻璃管吸取出來。有研究利用顯微操作后的標(biāo)本成功鑒定了152名胎兒性別、2例唐氏綜合征及2例性染色體缺失胎兒[8]，但該方法依賴手工操作，自動化程度較低。

免疫磁珠分離法及流式細(xì)胞術(shù)基于滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)抗原與其抗體的特異性結(jié)合而分離目標(biāo)細(xì)胞。G233為絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和中間滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)的人類白細(xì)胞抗原G(HLA-G)的特異性抗體，偶聯(lián)有該抗體的磁珠與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合，在外加磁場的作用下兩者復(fù)合物滯留在磁場中從而分離細(xì)胞，分離細(xì)胞純度達(dá)90%～100%，每個宮頸黏液標(biāo)本可獲得500～1 500個滋養(yǎng)層細(xì)胞，分離細(xì)胞具有絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞表型和完整核DNA(>95%)[9]。流式細(xì)胞術(shù)利用HLA-G的熒光抗體與滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)合，分選出高純度滋養(yǎng)層細(xì)胞，該技術(shù)也適用于胞質(zhì)內(nèi)抗原。這兩種方法分離的目標(biāo)細(xì)胞純度高，但由于抗體高度特異性以及標(biāo)本前期處理所造成的抗原破壞等因素會導(dǎo)致一定量的目標(biāo)細(xì)胞丟失。

激光捕獲顯微切割是基于細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞病理特點實現(xiàn)的細(xì)胞純化技術(shù)，有研究者切割形態(tài)學(xué)上具有細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞或者合體滋養(yǎng)層細(xì)胞特點的細(xì)胞，經(jīng)基因型分析確定平均每兩個微切割細(xì)胞中有一個為滋養(yǎng)層細(xì)胞，與免疫組化及原位雜交等技術(shù)相結(jié)合大大提高了該技術(shù)細(xì)胞純化的效率[10-11]，但也應(yīng)注意因切割精度所帶來細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)的損害。

差速貼壁培養(yǎng)法利用滋養(yǎng)層細(xì)胞與母體污染細(xì)胞在培養(yǎng)時的貼壁速度不同從而去除母體懸浮細(xì)胞。袁靜等[12]的研究中，滋養(yǎng)層細(xì)胞在差速貼壁培養(yǎng)中的培養(yǎng)成功率為95%，且成功鑒定了90%胎兒的性別，直接培養(yǎng)的對照組該細(xì)胞的培養(yǎng)成功率為96%，但是僅正確鑒定了38%胎兒的性別。該方法很大程度上依賴樣本中細(xì)胞的活性，宮頸標(biāo)本中的脫落細(xì)胞的活性是限制貼壁培養(yǎng)效率的最大障礙。

3 脫落滋養(yǎng)層細(xì)胞的鑒定

分離細(xì)胞的胎源性鑒定是利用滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷必不可少的步驟。所分離的細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫表型以及遺傳信息的分析確認(rèn)其為胎源性細(xì)胞，才能進(jìn)一步利用其進(jìn)行產(chǎn)前診斷，細(xì)胞鑒定方法的準(zhǔn)確性是基于滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷的關(guān)鍵所在。

形態(tài)學(xué)方法為在顯微鏡下觀察宮頸標(biāo)本涂片的蘇木精-伊紅染色(HE)結(jié)果，將滋養(yǎng)層細(xì)胞從眾多污染母體細(xì)胞中識別出來。宮頸滋養(yǎng)層細(xì)胞有細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、中間滋養(yǎng)層細(xì)胞及合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，其中合體滋養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)獨特，細(xì)胞大小形態(tài)多變，胞核小且深染,數(shù)目不一，大小一致，胞質(zhì)弱嗜酸性，易于辨別，但形態(tài)學(xué)鑒定方法主觀性強(qiáng)，疑似的細(xì)胞需經(jīng)免疫組化或者遺傳分析確定。

利用滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)的特異性抗原表位行免疫組化染色是細(xì)胞鑒定的常用方法，常用的鑒定抗體有G233、抗細(xì)胞角蛋白7(CK-7)抗體、抗人絨毛膜促性腺激素β(β-hCG)抗體、NDOG5、NDOG1、FT141.1等。G233、NDOG5與細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞特異結(jié)合[13-14]；NDOG1識別合體滋養(yǎng)層細(xì)胞[15]；FT141.1對滋養(yǎng)層細(xì)胞均識別[16]。β-hCG為滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的特異性蛋白，有研究用其進(jìn)行分離細(xì)胞純度鑒定[17]；抗CK-7抗體特異性低，與高特異抗體聯(lián)合染色可以抵消由特異性抗體所致的假陰性結(jié)果[18]。抗體自身特異性或者敏感性不足及標(biāo)本前處理導(dǎo)致的抗原破壞將降低免疫組化法細(xì)胞鑒定的效率，需探索特異度強(qiáng)、敏感度高的抗體組合，或者與分子生物學(xué)分析相結(jié)合，從而抵消方法學(xué)不足。

遺傳信息分析方法涉及熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等，通過識別胎兒細(xì)胞區(qū)別于母體的遺傳信息從而鑒定其胎源性。FISH用熒光染料標(biāo)記特定基因，如Y染色體上的DYZ1衛(wèi)星Ⅲ和X染色體上的DXZ1衛(wèi)星αDNA[19]，對陽性核進(jìn)行評估區(qū)分胎兒與母體細(xì)胞，并可以識別污染精子。與FISH相似，PCR擴(kuò)增特定基因如性別決定區(qū)域Y(SRY)，確定分離細(xì)胞的胎源性[9]，BUSSANI等[8]研究發(fā)現(xiàn)，PCR與FISH鑒定的效率相當(dāng)[20]，且由于難以區(qū)分父源衍生的X染色體與母體X染色體遺傳信息，兩者均局限于男性胎兒細(xì)胞的胎源性鑒定。由傳統(tǒng)PCR衍生而來的熒光定量PCR基于DNA多態(tài)性，引入高度多態(tài)性標(biāo)志如短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)，利用個體的雜合性，與母體細(xì)胞的STR譜相區(qū)別。由于X和Y染色體長臂假性染色體區(qū)域的五核苷酸和次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸-核糖基轉(zhuǎn)移酶STR等高度多態(tài)性標(biāo)記的引入使檢測不受標(biāo)本胎兒性別的影響，此外，利用給定STR位點熒光峰比例還可進(jìn)行非整倍體分析[15]。

4 診斷應(yīng)用

滋養(yǎng)層細(xì)胞分化來源于胎兒組織，與胎兒細(xì)胞具有相同的遺傳物質(zhì)，通過對其遺傳分析進(jìn)行產(chǎn)前診斷的方法經(jīng)研究，現(xiàn)已實現(xiàn)胎兒性別鑒定、多種染色體和單基因遺傳病的診斷及不良妊娠結(jié)局的預(yù)測等。

胎兒性別的診斷對于防止性連鎖遺傳病患兒的出生尤為重要，1971年SHETTLES[21]通過宮頸黏液標(biāo)本內(nèi)的Y小體熒光染色準(zhǔn)確鑒定出6名男性胎兒和4名女性胎兒的性別，盡管后續(xù)研究結(jié)果差異較大，但隨著FISH、PCR等技術(shù)的發(fā)展，診斷準(zhǔn)確性有了極大的改善。BOLNICK等[9]對5～20孕周孕婦細(xì)胞刷獲取的宮頸樣本分別進(jìn)行FISH、PCR等檢測正確診斷出所有胎兒性別。

染色體疾病是由于染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常所致的疾病，唐氏綜合征以及其他染色體疾病約占全世界新生兒的0.2%[19]，隨著孕婦年齡的增加，胎兒的患病風(fēng)險增大。基于宮頸脫落滋養(yǎng)層細(xì)胞的產(chǎn)前診斷已可實現(xiàn)21、18、13、X、Y等染色體異常的診斷[8,22-23]。SIFAKIS等[22]利用細(xì)胞刷獲取孕11～13周孕婦的宮頸黏液，通過FISH分析準(zhǔn)確診斷出5名唐氏綜合征的胎兒，單樣本中三倍體細(xì)胞數(shù)最多者可達(dá)27個。BIRON-SHENTAL等[24]加強(qiáng)了對孕早期宮頸滋養(yǎng)層細(xì)胞的認(rèn)識，通過孕早期宮頸樣本與胎盤組織的FISH雜交結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，在正常妊娠中，存在由于滋養(yǎng)層細(xì)胞的核內(nèi)復(fù)制導(dǎo)致的多倍體細(xì)胞的存在，但大多為四倍體，不會導(dǎo)致三倍體的假陽性結(jié)果。

單基因疾病超過7 000多種，總體發(fā)病率達(dá)3.5%，導(dǎo)致約20%的嬰兒死亡，以及10%的兒童住院率[25]。該類疾病種類繁多并逐年增加，且不易識別和診斷，是臨床診斷最為困難的病種。PFEIFER等[11]通過單細(xì)胞基因分析成功從21名8～12孕周的孕婦宮頸樣本中篩選出3名囊性纖維化及3名脊髓性肌萎縮癥胎兒。另外研究者們還利用宮頸滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目或者該細(xì)胞所表達(dá)蛋白的差異進(jìn)行不良妊娠結(jié)局預(yù)測[18,26]。

5 問題與展望

經(jīng)宮頸獲取滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行胎兒遺傳信息分析作為微創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法之一，與基于母血中胎兒細(xì)胞的產(chǎn)前分析相比，具備目標(biāo)細(xì)胞含量多、母體細(xì)胞污染相對少、不易受孕齡影響、與前胎妊娠不重疊等優(yōu)勢。相比于基于母體血漿中游離胎兒DNA的產(chǎn)前分析，該方法可以獲得完整的胎兒基因組，診斷結(jié)果可靠性高，并且不受特殊母體環(huán)境下游離腫瘤DNA的干擾，是應(yīng)用前景較廣的產(chǎn)前診斷方法，但也存在如下的問題。

首先，雖然樣本中母體細(xì)胞的污染程度顯著少于外周血，但是仍有大量母體細(xì)胞的存在，而且由于宮頸標(biāo)本性質(zhì)的特殊性，目標(biāo)細(xì)胞的分離仍是棘手的問題。其次，由于分離效率的不足，直接影響后期的鑒定及分析準(zhǔn)確性，且目前大多數(shù)研究間的分離和鑒定方法沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各方法間可比性差，操作主觀性強(qiáng)，故可靠性有待證實。再次，當(dāng)前研究在理論上或一些臨床試驗證實宮頸取材對繼續(xù)妊娠沒有影響，但研究主要的受試對象為待終止妊娠的孕婦，而無大規(guī)模隨機(jī)對照及產(chǎn)前診斷隨訪繼續(xù)妊娠的病例進(jìn)行比較的數(shù)據(jù)，故其安全性有待評估。最后，由于大多數(shù)研究是在單胎妊娠的情況下進(jìn)行的，對多胎妊娠進(jìn)行診斷時，可能存在分析結(jié)果與實際不符的現(xiàn)象。異卵雙生胎兒的其中之一自發(fā)性流失可以干擾正?；蚍钦扼w存活胚胎的DNA分析，從而導(dǎo)致假陽性或陰性檢測結(jié)果[15]，多胎妊娠診斷結(jié)果異常時，則必須通過羊膜腔穿刺等有創(chuàng)的方法進(jìn)行異常的胚胎判別。隨著單細(xì)胞數(shù)字PCR(dPCR)和液滴-測序(Drop-Seq)技術(shù)的發(fā)展和引入，上述問題將被逐步解決[27-28]。

綜上所述，基于宮頸滋養(yǎng)層細(xì)胞行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷應(yīng)用前景甚廣，但目前仍缺乏簡單、標(biāo)準(zhǔn)、穩(wěn)定、安全、可靠的適用于臨床常規(guī)分析的方法，技術(shù)水平上難以大范圍應(yīng)用于臨床實驗室診斷，因此，需要更多的研究。但其發(fā)展為應(yīng)用于臨床的微創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法是未來發(fā)展的必然趨勢。