間皮素在卵巢癌腫瘤微環(huán)境中作用的研究

王路遙，蔣晶，岳欣，陸?zhàn)?，霍利婷，王昊，王蓓蒂，GC GOMA，李佩玲

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中較為常見的一種，病死率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首，嚴重威脅女性健康和生命。由于大多數(shù)患者就診時已為晚期并且出現(xiàn)廣泛的腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移，卵巢癌患者5年生存率不足30%。但在發(fā)生轉(zhuǎn)移前診斷的卵巢癌患者，5年總生存率可超過90%[1]?？梢娞岣呗殉舶┑脑缙谠\斷率對治療和預后至關(guān)重要，而卵巢癌的早期癥狀和體征常呈非特異性而不易被早期發(fā)現(xiàn)。約90%的卵巢癌為上皮性卵巢癌（epithelial ovarian carcinoma，EOC），其中高級別漿液性癌（high-grade serous carcinoma，HGSC）占70%。50%～80%的HGSC患者在腫瘤進展的所有階段都存在p53突變。50%～70%有卵巢癌家族史的患者存在腫瘤抑制基因乳腺癌易感基因1（BRCA1）和BRCA2的突變。

由于卵巢癌復雜的重疊信號網(wǎng)絡，以及由間皮細胞、內(nèi)皮下基質(zhì)和脂肪組成的腹膜腫瘤微環(huán)境，該病至今仍缺乏根治方法，其主要死亡原因是難以控制腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移。與其他癌癥不同，卵巢癌特有的轉(zhuǎn)移方式是種植性轉(zhuǎn)移，即原發(fā)（卵巢/輸卵管）腫瘤的腫瘤細胞（單細胞或多細胞聚集體）脫落種植于其他部位，有別于傳統(tǒng)研究的血行轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞在脫落之前經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），導致E鈣黏蛋白（位于細胞連接處的糖蛋白）的丟失和侵襲性表型的產(chǎn)生，增加了卵巢癌細胞的擴散和侵襲能力。轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞由于體液流動而遍布腹腔，首先附著于覆蓋腹腔所有器官的間皮，包括網(wǎng)膜、腹膜和對側(cè)卵巢。播散的腫瘤細胞在網(wǎng)膜上的增殖最終導致胃腸梗阻等臨床癥狀[2]。

目前尚無有效的早期篩查卵巢癌的方法。現(xiàn)有的診斷方法包括婦科檢查、經(jīng)陰道超聲檢查和CA125的血清學測定。間皮素（mesothelin，MSLN）是1992年由Chang等[3]首次發(fā)現(xiàn)的一種在間皮細胞中表達并在EOC中過表達的糖蛋白，其可以作為新的腫瘤標志物和治療靶點。了解腫瘤和間皮素的相互作用以及腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境的分子機制對未來卵巢癌的治療具有重要意義。

1 CA125

CA125是1981年由Bast等[4]在用人卵巢癌細胞免疫的小鼠產(chǎn)生的單克隆抗體OC125中發(fā)現(xiàn)的一種高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，是黏蛋白16（MUC16）的重復肽表位，也是一種膜結(jié)合細胞表面黏蛋白，屬于包含O連接寡糖和N連接寡糖的黏蛋白家族。因為CA125在正常卵巢組織中低表達，而在卵巢癌中高表達，故其診斷的敏感度較高，但特異度較差。80%的EOC患者血清CA125升高，但近半數(shù)的早期病例并不升高，故血清CA125不單獨用于EOC的早期診斷。90%卵巢癌患者血清CA125與病程進展有關(guān)，通常用作監(jiān)測疾病進展和復發(fā)的標志物。CA125/MUC16可抑制卵巢癌自然殺傷細胞的細胞溶解反應，可抑制針對卵巢癌細胞的免疫應答[5]。盡管主流研究關(guān)注的是CA125在卵巢癌中的作用，但是Streppel等[6]的研究表明CA125在如腹膜間皮瘤、胰腺癌、結(jié)腸癌中也高表達，表明CA125與間皮細胞也存在相互作用。

2 間皮細胞

腹腔的所有器官都由間皮覆蓋。間皮是由纖維連接蛋白、膠原Ⅰ、膠原Ⅳ和層黏連蛋白組成的基底膜覆蓋單層間皮細胞構(gòu)成的。間皮細胞是來自中胚層的扁平鱗狀細胞，具有上皮和間質(zhì)雙重特性。其具有發(fā)達的細胞-細胞連接復合性（包括緊密連接），這對于細胞表面極性和半滲透性擴散屏障的形成和維持至關(guān)重要。間皮的功能是為器官和組織的自由運動提供保護屏障以及無摩擦的界面。間皮在促進腹膜腔內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、液體和細胞運輸、組織修復、炎癥的發(fā)生和結(jié)束以及腫瘤擴散等方面發(fā)揮著重要作用。在腫瘤微環(huán)境中，癌細胞分泌體預處理間皮細胞以誘導多種促炎因子的表達。間皮細胞參與EMT和間皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（mesothelial-to-mesenchymal transition，MMT，EMT樣過程）。EMT是上皮細胞失去細胞-細胞黏附并獲得遷移特性的生物學過程，MMT是腹腔間皮細胞獲得成纖維細胞樣表型、轉(zhuǎn)移能力增加的生物過程。腹膜和腹腔器官存在表達MSLN的間皮細胞，使脫落的卵巢癌細胞易發(fā)生黏附和轉(zhuǎn)移。

3 MSLN

人MSLN基因位于染色體16p13.3上，長度約為8 kb，由16個長度為7 733 bp的外顯子組成。在異常過表達MSLN的癌細胞中，18 bp的增強子序列CanScript位于MSLN基因的啟動子區(qū)的3個轉(zhuǎn)錄起始位點的5′端-65～-46 bp區(qū)間。CanScript由2個功能上假定結(jié)合的基序組成：傳統(tǒng)的MCAT元件和SP1樣元件。MCAT元件中的8個核苷酸都顯示出其功能的必要性。而SP1樣元件存在2個突變，表明MSLN的癌癥特異性表達是通過與未知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)生的。但已研究的轉(zhuǎn)錄因子[如Kruppel樣因子6（KLF6）和 Yes相關(guān)蛋白 1（YAP1）]不足以證明某些癌癥的MSLN過表達，因而在人類癌癥中調(diào)節(jié)MSLN過表達的基本轉(zhuǎn)錄因子尚未確定[7]。

MSLN的前體蛋白是長約70 ku的糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定的膜糖蛋白，可以在精氨酸295（Arg295）處被蛋白水解酶水解成兩部分，分別為30 ku的巨核細胞增強因子（megakaryocyte potentiating factor，MPF）和40 ku的具有細胞黏附性的MSLN膜結(jié)合片段。盡管許多預測程序試圖預測前體MSLN和成熟MSLN的三維結(jié)構(gòu)，但該結(jié)構(gòu)目前仍然未知。Hellstrom等[8]研究發(fā)現(xiàn)MSLN主要表達于胸膜、心包膜和腹膜的間皮細胞表面，并能釋放到多種腫瘤患者的體液中。MSLN在正常的間皮細胞中微量表達，而在70%的卵巢癌、間皮瘤和胰腺癌中高表達，因此可以作為相關(guān)的腫瘤標志物[9]。敲除MSLN基因的小鼠不呈現(xiàn)異常表型，表明MSLN是非必需蛋白，故其生物學功能尚不完全清楚。目前已知MSLN通過絲裂原活化蛋白激酶/胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（MAPK/ERK）和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路誘導耐藥，從而增加卵巢癌的侵襲性，顯示出致癌特性，在細胞黏附、腫瘤演進和化療耐藥中均發(fā)揮作用。

4 MSLN和CA125

CA125是MSLN的配體，二者共同介導細胞黏附。Rump等[10]證實MSLN與CA125相互結(jié)合成為MSLN:CA125復合體，介導人卵巢癌細胞系（OVCAR3）的異型細胞黏附。Gubbels等[11]研究發(fā)現(xiàn)MSLN以一種特定的N連接糖依賴途徑與CA125結(jié)合，因此表達CA125的卵巢癌細胞可以特異性地與表達MSLN的腹膜間皮相結(jié)合。因此，MSLN:CA125復合體介導的細胞黏附在卵巢癌細胞腹膜種植中可能起到重要作用[12]。卵巢癌細胞附著于腹膜間皮后，MSLN和CA125的共同過表達可導致更多卵巢癌細胞從原發(fā)部位脫落。因此，轉(zhuǎn)移病灶可能是腹水循環(huán)中單細胞或多細胞聚集體的過度增殖和黏附的結(jié)果。MSLN在腫瘤進展中的確切功能尚不清楚，但研究MSLN與CA125結(jié)合發(fā)揮的作用可以為尋求抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移的新療法提供思路。

5 MSLN作為腫瘤標志物的應用

闡明MSLN的功能有助于卵巢癌的早期發(fā)現(xiàn)，化療效果的提高，預后的改善和新靶向治療方法的研究[13]。首先，MSLN良好的內(nèi)化作用使其成為良好的免疫毒素靶點。其次，MSLN可以從細胞表面快速脫落，此過程由卸離酶和腫瘤壞死因子α（TNF-α）轉(zhuǎn)化酶（TACE）介導。TACE是一種跨膜糖蛋白，可以調(diào)節(jié)表皮生長因子受體（EGFR）途徑的激活，因其從細胞表面釋放EGFR配體而得名。脫落的MSLN在腹水或血液循環(huán)中產(chǎn)生大量抗原，因此可定量測定循環(huán)血清的MSLN水平用于早期診斷卵巢癌。研究組發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者手術(shù)治療后血清MSLN水平下降，說明MSLN可以用于監(jiān)測卵巢癌的治療效果[14]。

6 分子影像學在MSLN檢測中的應用

MSLN可以作為分子成像探針的檢測靶點評估卵巢癌的治療效果，檢測原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移病灶的分布[15]。Prantner等[16]研究了抗 MSLN 納米抗體（NbG3a）的特性，NbG3a對MSLN具有高親和力和特異性，可用于常規(guī)或基于納米技術(shù)的疾病診斷、治療和預后。該研究表明NbG3a作為新型分子成像探針的可能性，及其在人體成像和治療應用中的無限前景?？贵w-藥物偶聯(lián)物（ADC）利用單克隆抗體作為載體，可選擇性地向靶向腫瘤細胞遞送有效的細胞毒藥物，而對標記的單克隆抗體進行分子成像則有助于預測ADC療效。Terwisscha van Scheltinga等[17]研究發(fā)現(xiàn)，用鋯89（89Zr）標記的單克隆抗MSLN抗體聯(lián)合免疫正電子發(fā)射計算機斷層掃描（PET）法進行分子成像，可以測定其ADC（抗MSLN抗體－單甲基抗體Auristain E）抑制腫瘤生長的功效。此外，Sirois等[18]研究發(fā)現(xiàn)非抗體蛋白支架能高度特異性結(jié)合MSLN，且其具有體積小、可快速清除的優(yōu)點，可用于識別小鼠模型中表達MSLN的腫瘤細胞，在臨床前和臨床評價中都取得了良好的效果。

7 臨床試驗

7.1 免疫毒素SS1P的臨床試驗免疫毒素是目前在惡性腫瘤臨床試驗中研發(fā)的新型抗體結(jié)合治療劑，由抗體靶向結(jié)構(gòu)域與細菌毒素融合而成，用于細胞殺傷[19]。Alewine等[20]設計了一種MSLN靶向免疫毒素SS1P，其由抗MSLN抗體的Fv部分與假單胞菌外毒素A（PE38）的截短部分組成而成。SS1P的細胞殺傷機制分為3個步驟：①SS1P與細胞表面的MSLN結(jié)合；②SS1P通過MSLN介導的內(nèi)化過程進入細胞，其假單胞菌外毒素A（pseudomonas exotoxin A）部分易位至胞質(zhì)；③PE分子引起延伸因子2（EF-2）的二磷酸腺苷（ADP）核糖基化，導致蛋白質(zhì)合成和凋亡的停滯。研究表明SS1P對間皮瘤細胞毒性很大，盡管正常組織中MSLN表達水平低，但患者對其耐受性良好，Ⅰ期臨床試驗中患者不良反應較少。Kreitman等[21]和Hassan等[22]進行的Ⅰ期臨床試驗研究了間皮瘤、卵巢癌和胰腺癌患者連續(xù)輸注（continuous infusion）SS1P或大劑量靜脈輸注（bolus i.v.infusion）SS1P的2種不同給藥模式的臨床效果，均表現(xiàn)出良好的耐受性和適度的臨床活性，其結(jié)果支持SS1P臨床治療，但SS1P的治療效果還需Ⅱ期臨床試驗繼續(xù)評估。

7.2 抗MSLN嵌合單克隆抗體的臨床試驗MORAb-009是一種抗MSLN嵌合單克隆抗體[23]。Hassan等[24-25]進行了Ⅰ期臨床試驗確定其安全性，劑量限制性毒性（DLT）和最大耐受劑量（MTD）。應用MORAb-009治療的間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌患者的血清CA125水平顯著增加（包括治療前CA125未升高的患者）。此種情況不是由于疾病進展，因為在停止MORAb-009治療后CA125水平迅速下降。其原因可能是MORAb-009能夠抑制腫瘤脫落的CA125與存在于腹壁和腹膜腔的間皮細胞上的MSLN的結(jié)合。此研究表明抑制MSLN:CA125相互作用可能是預防間皮瘤和卵巢癌中腫瘤轉(zhuǎn)移的有用方法。

7.3 腫瘤疫苗的臨床試驗在Le等[26]進行的Ⅰ期臨床試驗中，活減毒斯特菌（Lm）菌株經(jīng)工程改造后可成為表達人MSLN的腫瘤疫苗CRS-207。CRS-207可誘導特異性T細胞對表達MSLN的鼠腫瘤產(chǎn)生免疫反應，并且人體對其具有良好的耐受性，不良反應較少。該研究不僅證明了疫苗的安全性和耐受性，而且表明經(jīng)腫瘤抗原修飾的Lm疫苗可誘導晚期癌癥患者的腫瘤抗原特異性T細胞反應，提示MSLN可作為潛在腫瘤治療靶點，改善腫瘤治療的臨床效果。

7.4 新型MSLN靶向ADC的臨床試驗Anetumab ravtansine（BAY94-9343）是一種新型MSLN靶向ADC，其由人抗MSLN抗體與微管蛋白抑制劑DM4連接而成[27]。Golfier等[28]進行的Ⅰ期臨床試驗研究BAY94-9343對晚期實體瘤（包括卵巢癌和間皮瘤）患者的安全性和最大耐受劑量。Ⅰb期臨床試驗中，聚乙二醇化脂質(zhì)體阿霉素和BAY94-9343聯(lián)合應用，用于治療表達MSLN的鉑耐藥性復發(fā)性卵巢癌、輸卵管癌或原發(fā)性腹膜癌，以研究BAY94-9343的最大耐受劑量。研究證實BAY 94-9343在體外對MSLN陽性細胞具有選擇性細胞毒性，且不影響MSLN陰性或非增殖細胞；在體內(nèi)能夠高效結(jié)合人MSLN以誘導抗原內(nèi)化作用，特異性地定位于MSLN陽性腫瘤細胞并且在皮下和原位種植轉(zhuǎn)移模型中抑制腫瘤生長。研究表明BAY 94-9343的抗腫瘤功效與MSLN的表達量相關(guān)，可開發(fā)用于治療表達MSLN的腫瘤患者。

8 結(jié)語

卵巢癌是女性患者中最致命的婦科惡性腫瘤，發(fā)現(xiàn)時常已為晚期伴有廣泛腹腔轉(zhuǎn)移。MSLN是一種在間皮細胞中正常表達，而在卵巢癌、胰腺癌、間皮瘤等疾病中高度表達的糖蛋白，這使其成為靶向治療的新熱點，針對MSLN的免疫療法正在進行臨床試驗。MSLN:CA125復合體介導的細胞黏附在卵巢癌細胞腹膜種植中可能起重要作用，而干擾MSLN:CA125結(jié)合的新方法正在研究進行中。雖然MSLN與許多癌癥有關(guān)，但其確切的作用仍不清楚，值得進一步研究和臨床試驗研究。MSLN在腫瘤轉(zhuǎn)移中的潛在作用需要進一步的機制研究，這可能為幾種癌癥的有效的MSLN靶向治療提供新思路。