絲素蛋白支架修復(fù)骨軟骨損傷研究進展

柳昌全 王進 趙廣雷 石晶晟 陳杰 黃鋼勇 陳飛雁 魏亦兵 王思群 夏軍

骨軟骨損傷在臨床骨科較為常見，該損傷同時累及上方的關(guān)節(jié)軟骨和下方的軟骨下骨，其自身修復(fù)能力差[1-2]。目前，骨軟骨損傷主要采用手術(shù)治療，相應(yīng)方法均取得一定的修復(fù)效果，但仍存在不足[3]。近年來，組織工程技術(shù)在骨軟骨損傷修復(fù)中得到廣泛應(yīng)用，絲素蛋白為熱點材料之一。絲素蛋白具有良好的生物相容性、可控的降解速率(持續(xù)數(shù)小時至數(shù)年)以及卓越的機械性能，且與人體骨的有機成分類似[4-5]。目前應(yīng)用于組織工程的絲素蛋白常有以下幾種形式：絲素蛋白薄膜、電紡和濕紡絲素蛋白纖維、絲素蛋白凝膠、3D多孔絲素蛋白支架、絲素蛋白微粒等[6]。其中支架形式的絲素蛋白在應(yīng)用時常會與其他材料、生物因子混合，有時還會借助生物反應(yīng)器裝置，以提高相應(yīng)支架的機械性能、生物相容性和降解性能等。

1 與骨軟骨修復(fù)相關(guān)的絲素蛋白支架

從組織工程角度看，想重建組織功能，首先需重建組織的正常結(jié)構(gòu)。因此，在骨軟骨修復(fù)中，出現(xiàn)了單相、雙相和三相支架這類能更好模擬骨軟骨結(jié)構(gòu)的支架。單相支架由1種材料或1種無空間變化的復(fù)合材料制成。從細(xì)胞或生物學(xué)的角度來看，單相支架在整個支架結(jié)構(gòu)中僅有1個細(xì)胞類型，而且沒有相應(yīng)生物活性分子的變化分布；與之對應(yīng)的，雙相和三相支架使用2～3種材料或復(fù)合材料來構(gòu)建相應(yīng)的多層結(jié)構(gòu)，在不同支架層中播種不同類型的細(xì)胞，或加入生物活性分子于不同支架層來創(chuàng)建多個生物環(huán)境[7]。應(yīng)用于骨軟骨修復(fù)的絲素蛋白支架亦可用上述分類法。

1.1 絲素蛋白單相支架

絲素蛋白單相支架常采用絲素蛋白或復(fù)合其它材料的絲素蛋白制成，復(fù)合材料中通常包括：天然聚合物，如膠原蛋白、明膠、糖胺聚糖、殼聚糖、淀粉、透明質(zhì)酸、藻酸鹽、細(xì)菌來源的聚合物(羥基鏈烷酸酯)；無機物，如羥基磷灰石、磷酸三鈣、生物活性玻璃；合成聚合物，如聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚乳酸、聚己內(nèi)酯和聚乙二醇[8]。由絲素蛋白或復(fù)合其它材料的絲素蛋白制成的支架常具有良好的降解率以及不同的強度和孔隙率，能夠較好模擬周圍組織的特性，從而促進與宿主組織的充分整合。

一些實驗結(jié)果也表明，此類單相支架可為軟骨細(xì)胞或骨細(xì)胞的黏附和擴增提供良好支持。Augst等[9]將種植了人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)的絲素蛋白單相支架分別置于成骨組、成軟骨組、對照組的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，然后將成骨組和成軟骨組的支架融合成復(fù)合材料，再分別置于成骨組、成軟骨組、對照組的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周。實驗結(jié)果顯示，在復(fù)合培養(yǎng)過程中(3～6周)，軟骨組織和骨組織在3種培養(yǎng)基中均有形成，但骨樣組織形成優(yōu)于軟骨組織。Kazemnejad等[10]用再生絲素蛋白/天然絲素蛋白制作單相支架，實驗中他們將支架與兔自體軟骨細(xì)胞復(fù)合，然后植入小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)帶自體軟骨細(xì)胞的支架較不帶細(xì)胞的支架有更強的修復(fù)能力；在支架植入36周后發(fā)現(xiàn)，帶自體軟骨細(xì)胞支架修復(fù)部位，大部分顯示出再生的透明樣軟骨。但單相支架也有缺點，如缺乏再生骨軟骨組織的內(nèi)在物理結(jié)構(gòu)等[11-12]。

1.2 絲素蛋白雙相支架

由絲素蛋白構(gòu)建的雙相支架常具有剛性的軟骨下骨層，該層用以支撐覆蓋的軟骨并與天然骨骼結(jié)合，而支架的軟骨層則用于種植和擴增軟骨細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的后續(xù)沉積。支架的軟骨層常由單獨的絲素蛋白或絲素蛋白與天然糖類的聚合物(如糖胺聚糖、殼聚糖、淀粉、透明質(zhì)酸和藻酸鹽等)混合制成[13]，軟骨下骨層常由絲素蛋白和無機物(如羥基磷灰石、磷酸三鈣、生物活性玻璃等)混合制成[11]。通過此方法合成的軟骨層及軟骨下層能夠在生化、物理性能方面更好地模擬真實組織，從而在骨軟骨修復(fù)方面有更好的應(yīng)用前景。Chen等[14]制作了絲素蛋白-RADA肽鏈(軟骨相)/絲素蛋白-RADA肽鏈(軟骨下骨相)雙相支架，軟骨相和軟骨下骨相同時種植兔間充質(zhì)干細(xì)胞。實驗中將軟骨相置于成軟骨性培養(yǎng)液中，軟骨下骨相置于成骨性培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，通過基因表達檢測、組織學(xué)和生化分析等發(fā)現(xiàn)，在成軟骨性培養(yǎng)液中的支架形成了類似軟骨的結(jié)構(gòu)，成骨性培養(yǎng)液中的支架形成了類似軟骨下骨的結(jié)構(gòu)，兩者交界處則發(fā)現(xiàn)了類似軟骨結(jié)構(gòu)中鈣化層的結(jié)構(gòu)。Zhang等[15]制作了膠原蛋白(軟骨相)/絲素蛋白-羥基磷灰石(軟骨下骨相)雙相支架并在支架上種植兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSC)。在動物體內(nèi)實驗中，他們發(fā)現(xiàn)，植入該雙相支架結(jié)合關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射甲狀旁腺激素4～6周，能夠有效抑制細(xì)胞的終末分化，促進軟骨形成，改善軟骨的修復(fù)和再生。然而雙相支架也存在一定的缺陷，如在機械強度上達不到真實組織的程度，軟骨層與軟骨下骨層結(jié)合不牢固，支架破壞下沉，軟骨相纖維軟骨形成等[16]。

1.3 絲素蛋白三相支架

三相支架中比雙相支架多出的界面層常使用絲素蛋白和無機物(如羥基磷灰石、磷酸三鈣、生物活性玻璃等)混合制成，其較雙相支架更好地模擬了骨軟骨的結(jié)構(gòu)層次。Ding等[17]制作了絲素蛋白(軟骨相)/絲素蛋白-羥基磷灰石(中間相)/絲素蛋白-羥基磷灰石(軟骨下骨相)三相支架。細(xì)胞實驗表明，該支架具有很好的生物相容性，能夠支持脂肪干細(xì)胞(ADSC)的生長、增殖和浸潤。組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色、實時PCR檢測證實，在體外成軟骨或成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，ADSC能夠分別在軟骨相和軟骨下骨相向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化，而中間相能夠起分離作用，即阻止軟骨相和軟骨下骨相的細(xì)胞混合。?akmak等[18]制作了兩性蛋白凝膠(軟骨相)/4%絲素蛋白(中間相)/6%絲素蛋白+5%羥基磷灰石(軟骨下骨相)三相支架，其中軟骨相種植人羊膜細(xì)胞(hAC)，軟骨下骨相種植人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。實驗中他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)軟骨相和軟骨下骨相分別在成軟骨性、成骨性培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)時，相應(yīng)細(xì)胞表現(xiàn)出良好的生存能力和增殖性。當(dāng)該三相支架在共培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)時，堿性磷酸酶、成骨標(biāo)記物、鈣含量檢測和組織學(xué)染色的檢測結(jié)果表明，在該共培養(yǎng)體系中hAC的存在極大地促進了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨性分化，而且hAC能夠在缺乏轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β家族的條件下依然在相應(yīng)的軟骨區(qū)域產(chǎn)生大量糖胺聚糖。但是，目前三相支架界面層的制作工藝仍有一定缺陷，這是急需解決的問題[7]。

2 絲素蛋白支架的組織工程要素

骨軟骨組織工程的發(fā)展趨勢是利用多相支架模擬天然的骨軟骨組織的多相性。多相絲素蛋白支架的應(yīng)用常涉及多種材料、細(xì)胞以及生長因子，此外，近年來生物反應(yīng)器在組織工程中的作用越發(fā)明顯。

2.1 細(xì)胞

在用絲素蛋白支架進行骨軟骨修復(fù)時，通常在支架部位種植相應(yīng)細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。使用軟骨細(xì)胞在很多方面存在困難，比如細(xì)胞難以分離[19]，容易在培養(yǎng)和擴張過程中失去表型等[20]，因此，骨軟骨修復(fù)時常使用成骨細(xì)胞或MSC，其中又以后者居多，主要利用其良好的增殖特性及多相分化潛能[21]。

在使用絲素蛋白雙相或多相支架時，學(xué)者們常將MSC分別與支架的軟骨相及軟骨下骨相結(jié)合，先在體外的成骨性或成軟骨性培養(yǎng)基中培養(yǎng)后種植于實驗動物的骨軟骨缺損處，或不經(jīng)培養(yǎng)直接種植于缺損處。相關(guān)實驗結(jié)果已表明，此類支架修復(fù)效果良好。Li等[22]制作絲素蛋白(軟骨相)/絲素蛋白-SHG生物活性陶瓷(軟骨下骨相)雙相支架，該支架的軟骨相和軟骨下骨相有不同的孔隙率，能夠很好地模擬真實組織的孔隙情況。該支架上種有hMSC，體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，該支架的軟骨相和軟骨下骨相中的hMSC能夠分別向成軟骨性和成骨性細(xì)胞分化。Yan等[23]制作絲素蛋白(軟骨相)/絲素蛋白-納米級磷酸鈣(軟骨下骨相)雙相支架用于修復(fù)骨軟骨缺損。在細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn)，rBMSC在該支架上有很好的黏附及增殖特性；相關(guān)實驗結(jié)果也表明rBMSC在這類支架中能夠分別進行成骨性和成軟骨性分化，提示該種支架有望應(yīng)用于骨軟骨修復(fù)。Ruan等[24]制作絲素蛋白-殼聚糖(軟骨相)/絲素蛋白-殼聚糖-羥基磷灰石(軟骨下骨相)3D雙相支架，他們發(fā)現(xiàn)，BMSC能夠很好地在該支架上增殖、生長，并且在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，通過該支架的軟骨相和軟骨下骨相BMSC的成軟骨性和成骨性增殖分化，能夠在一定程度上修復(fù)骨軟骨缺損。

2.2 生長因子

雖然已有大量實驗證據(jù)表明，絲素蛋白能夠在一定程度上促進骨和軟骨形成，但促進程度有限。因此，常需要在絲素蛋白支架上添加一定的生長因子，常用者為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2、BMP-7、TGF-β、胰島素樣生長因子(IGF)-Ⅰ及其組合，應(yīng)用時它們常被制備成溶液或被包裹于微球內(nèi)。生長因子在體內(nèi)、體外對骨軟骨形成起重要作用，一些因子已被驗證在特定濃度下能夠促進骨軟骨形成[3]，但如果沒有被正確應(yīng)用，有時也可能產(chǎn)生不良后果[25]。目前常用因子中，BMP-2、TGF-β能夠促進軟骨形成[25-26]、重組人胰島素樣生長因子(rhIGF)-Ⅰ能夠促進重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白(rhBMP)-2相應(yīng)的促成骨、成軟骨能力等[27]。

Vunjak-Novakovic等[28]早在2005年就提出，可使用生長因子梯度性變化構(gòu)建相應(yīng)的絲素蛋白雙相支架。他們制作了一類絲素蛋白支架，并且共價結(jié)合IGF-Ⅰ(促軟骨生成)和BMP-2(促骨生成)2類因子，這2類因子的濃度在支架上呈現(xiàn)反向的趨勢，分別從支架一端到另一端遞增，BMP-2濃度高的一端具有成骨性，IGF-Ⅰ濃度高的一端具有成軟骨性，然后利用該支架進行相應(yīng)實驗。在該文獻中，作者并未展示實驗結(jié)果，但提出的該類“同時進行骨軟骨修復(fù)”支架的新觀念，為后續(xù)研究提供了新的思路。

在聚合物支架中，對生長因子傳遞時間和空間的控制至關(guān)重要。Wang等[29]制作一種多孔的雙相絲素蛋白支架，分別將rhBMP-2絲素蛋白微球、rhIGF-Ⅰ絲素蛋白微球和rhBMP-2/rhIGF-Ⅰ絲素蛋白微球與之融合，然后將hMSC種植于3類支架上，并在具有成骨性和成軟骨性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。5周后，hMSC在與rhBMP-2絲素蛋白微球、rhBMP-2/rhIGF-Ⅰ絲素蛋白微球融合的支架上展現(xiàn)出成骨性和成軟骨性分化，這提示絲素蛋白微球傳遞rhBMP-2優(yōu)于傳遞rhIGF-Ⅰ。這種新穎的絲素蛋白微球/支架系統(tǒng)為多種生長因子的傳遞提供了新選擇，通過對其三維培養(yǎng)環(huán)境的空間控制，研究者可進一步理解自然組織生長過程，還能在體外進行復(fù)雜的組織工程研究。

Saha等[30]分別用2種原材料(家蠶蠶絲、印度柞蠶蠶絲)制作單相絲素蛋白支架，在體內(nèi)實驗中他們發(fā)現(xiàn)，復(fù)合了TGF-β3或BMP-2的無細(xì)胞絲素蛋白支架上有新生的骨軟骨組織生長，且新生組織與原有組織能很好地融合。這項研究提出了“用不同原材料的絲素蛋白支架組合修復(fù)骨軟骨缺損”的設(shè)想，同時也驗證了TGF-β3、BMP-2具有促進骨軟骨組織生長的能力。

2.3 生物反應(yīng)器

僅靠絲素蛋白支架、生長因子和細(xì)胞的完美結(jié)合還不能夠成功再生骨軟骨結(jié)構(gòu)，為了維持分化細(xì)胞的表型并促進其結(jié)構(gòu)成熟，需要生物反應(yīng)器進行環(huán)境控制。生物反應(yīng)器能夠充分復(fù)制體內(nèi)的生物環(huán)境，在支架內(nèi)為相應(yīng)的種子細(xì)胞提供營養(yǎng)支持，促進細(xì)胞與周圍環(huán)境的物質(zhì)傳遞，提供相應(yīng)的物理和化學(xué)信號刺激，有助于骨軟骨組織再生[31]。組織工程骨軟骨組織生物反應(yīng)器原則上至少包含2個分區(qū)：軟骨部分和骨部分(包括中間的接合部)，這有利于在相應(yīng)區(qū)域為細(xì)胞提供用于形成特定組織結(jié)構(gòu)的環(huán)境傳導(dǎo)和刺激因素(包括提供特定培養(yǎng)基)。在軟骨相，提供軟骨生長因子結(jié)合動態(tài)負(fù)荷；在骨相，提供成骨生長因子結(jié)合間隙流動的介質(zhì)來促進養(yǎng)分轉(zhuǎn)移及提供所需的剪切應(yīng)力。在這種仿生生物反應(yīng)器中，軟骨相和骨相各部分都受到足夠刺激，同時生長，從而達到“形成類似于原生骨軟骨結(jié)構(gòu)的骨軟骨組織”的目的[10]。

應(yīng)用生物反應(yīng)器使得“以rBMSC作為單細(xì)胞來源進行多層骨軟骨構(gòu)建”的單步方法具備可行性，且在構(gòu)建相應(yīng)骨軟骨組織時可以不預(yù)先將支架與細(xì)胞共混培養(yǎng)。Chen等[32]采用獨特的兩室共培養(yǎng)方式培養(yǎng)帶有rBMSC的絲素蛋白-RADA肽鏈支架，2個間室分別含有成骨性和成軟骨性培養(yǎng)液；實驗結(jié)果顯示，成骨性培養(yǎng)液中支架形成了類似軟骨下骨的結(jié)構(gòu)，成軟骨性培養(yǎng)液中支架形成了類似軟骨的結(jié)構(gòu)，交界處支架出現(xiàn)了類似于軟骨結(jié)構(gòu)中鈣化層的結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)語

已有越來越多的研究者將絲素蛋白支架運用于骨軟骨修復(fù)的研究。從單相絲素蛋白支架到多相絲素蛋白支架，從單純絲素蛋白支架到載有細(xì)胞、生長因子的絲素蛋白支架，支架結(jié)構(gòu)越來越接近骨軟骨結(jié)構(gòu)，相關(guān)實驗的效果也越來越好。然而，應(yīng)用絲素蛋白支架進行骨軟骨損傷修復(fù)還存在著很多問題。例如，在雙相和多相支架中如何優(yōu)化軟骨層和軟骨下骨層之間界面層的構(gòu)建以及不同相之間的連接；如何解決支架在植入動物體內(nèi)后容易出現(xiàn)塌陷的問題；在雙相、多相支架中如何準(zhǔn)確誘導(dǎo)不同相中的干細(xì)胞分別向相應(yīng)的骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化；如何避免在支架植入后纖維軟骨形成等。隨著材料學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進步，絲素蛋白及其復(fù)合材料在骨軟骨損傷修復(fù)的應(yīng)用范圍和前景會更加廣闊。