魯氏酵母和球擬酵母不同接種方式 對高鹽稀態(tài)釀造醬油品質的影響

郭建，伍學明，樊君，左上春，劉英

(1.千禾味業(yè)食品股份有限公司，四川 眉山 620000；2.四川省調味品添加劑工程技術中心，四川 眉山 620010)

醬油是一種起源于我國的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，它的歷史可以追溯到2000多年前[1]。目前，醬油的釀制方法包括高鹽稀態(tài)發(fā)酵、低鹽固態(tài)發(fā)酵和固稀結合的發(fā)酵方式[2]，其中高鹽稀態(tài)發(fā)酵方法日益成為國內醬油釀制的主流方法。高鹽稀態(tài)釀造方法便于實現(xiàn)工業(yè)化、節(jié)約化、清潔化生產，并且采用高鹽稀態(tài)法釀制的醬油呈香濃郁、品質優(yōu)良。

多種微生物參與到醬油釀造過程中[3]，伴隨發(fā)酵的進行，醬醪微生物呈現(xiàn)此消彼長，菌群不斷更替，賦予醬油豐富濃厚的滋味。在眾多的微生物中，耐鹽酵母是醬油釀造的主發(fā)酵菌株，耐鹽酵母產生的酯類、醇類、醛類等物質對醬油的香味影響最大[4]。用于醬油釀造的耐鹽酵母主要包括魯氏酵母、球擬酵母和假絲酵母，其中尤以魯氏酵母和球擬酵母應用最廣。關于魯氏酵母和球擬酵母的報道較多，但是不同來源的魯氏酵母和球擬酵母對于釀造醬油的影響缺乏研究，本文選取4株具有代表性的魯氏酵母和球擬酵母應用于醬油發(fā)酵，并深入考察了它們對醬油風味物質形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

米曲霉3.402，莫格球擬酵母CICC 1708，白球球擬酵母CICC 1019，魯氏接合酵母CICC 1379和CICC 1417：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 耐鹽酵母斜面培養(yǎng)基

酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，氯化鈉100 g/L，瓊脂粉20 g/L。

1.1.2.2 耐鹽酵母液體培養(yǎng)基

醬油原油，氯化鈉120 g/L，葡萄糖60 g/L。

1.1.2.3 制曲培養(yǎng)基

小麥炒熟，豆粕在121 ℃條件下滅菌20 min，然后按照小麥∶豆粕為3∶7的比例進行混合，接種種曲后于30 ℃培養(yǎng)得成曲。

1.1.3 儀器與設備

Alkomat酒精檢測儀 德國福林斯生化技術有限公司；分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；GC-MS氣質聯(lián)用儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母培養(yǎng)

鮮蝦中添加9%，12%，15%的食鹽，于4 ℃冰箱中冷藏，每15天取樣觀察并檢測蝦醬理化及微生物指標。

1.2.2 發(fā)酵

配制23%的鹽水，按大曲∶鹽水為1∶2加入鹽水，攪拌均勻后于33 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵。

1.2.3 接種耐鹽酵母

單獨接種魯氏酵母或者球擬酵母按照106/mL的接入量接入，發(fā)酵第7天接入耐鹽酵母。組合接入魯氏酶和球擬酵母的方法：發(fā)酵第7天接入魯氏酵母，發(fā)酵第22天接入球擬酵母。

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 生香酵母生長性能的測定

在斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)生香酵母于30 ℃培養(yǎng)2 天，之后用接種針接入1環(huán)至耐鹽酵母液體培養(yǎng)基中，其中氯化鈉的加入量分高鹽(18%)和低鹽(12%)2種，于30 ℃培養(yǎng)，間隔4 h取樣。將待測樣液10倍稀釋后用分光光度計測定吸光度值。

1.2.4.2 還原糖的測定

醬油還原糖的測定采用DNS法，具體步驟參照Zhu等[5]的方法。

1.2.4.3 乙醇濃度的測定

取100 mL待測醬油，加入100 mL蒸餾水，經蒸餾后得100 mL餾出液，將餾出液用Alkomat酒精檢測儀測定酒精度即可。

1.2.4.4 醬油關鍵性呈香物質濃度的測定

采用王春玲等的測定方法測定4-EG和HEMF的濃度[6]，采用Agilent 5977E GC/MSD氣質聯(lián)用儀和CBP-20 極性毛細管柱(50 m×0.25 mm)。色譜條件：起始溫度60 ℃，保持10 min，以5 ℃/min進行升溫，最終溫度180 ℃，保持15 min；氫氣流速47.0 mL/min，空氣流速400.0 mL/min，分流比20∶1，F(xiàn)ID 檢測器，檢測器溫度250 ℃，進樣口溫度 250 ℃，進樣量1 μL。

1.2.5 數據分析

所有試驗均做3個平行，數據顯示為平均值±均方差。

2 結果與分析

2.1 生香酵母生長性能比較

在液體培養(yǎng)條件下，對2株魯氏接合酵母和2株球擬酵母在高鹽(18%)和低鹽(12%)2個濃度下的生長性能進行了比較(見圖1)。高鹽條件下，莫格球擬酵母CICC 1708的生長性能明顯優(yōu)于其他3株菌，白球球擬酵母CICC 1019的生長最為緩慢，2株魯氏接合酵母CICC 1379和CICC 1417生長性能則差別不大。

與高鹽條件下相似，低鹽條件下莫格球擬酵母CICC 1708依然生長最快，而白球球擬酵母CICC 1019的生長最慢，但是所有生香酵母的生長性能明顯優(yōu)于高鹽條件，說明隨著鹽濃度的提高，生香酵母的繁殖受到了明顯的抑制。

目前，國內釀造醬油主要采用高鹽稀態(tài)的釀制方法，因此需要在高鹽條件下發(fā)酵性能優(yōu)越的菌株。當然，僅具備高鹽條件下良好的生長性能是不夠的，還需要耐鹽酵母生成豐富的呈香物質以提升醬油品質。

圖1 生香酵母在高鹽(A)和低鹽(B)條件下的生長曲線Fig.1 The growth curve of aroma-producing yeasts under high-salt(A) or low-salt(B) condition

2.2 氨基酸態(tài)氮在發(fā)酵過程中的變化

通過Ehrlich途徑，生香酵母可以將醬醪中的氨基酸轉化為短鏈脂肪酸和短鏈支鏈醇[7]。適量地將醬油中的氨基酸轉化為短鏈脂肪酸和短鏈支鏈醇有助于改善醬油風味、提升醬油品質，而氨基酸過多地消耗則有損醬油品質。不同的生香酵母利用氨基酸的能力存在差異，因而生香酵母的加入可能導致醬醪中氨基酸態(tài)氮的含量發(fā)生變化。在發(fā)酵第10天分別接種4種生香酵母，并分別測定了發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的變化情況。

圖2 分別接種4種生香酵母后氨基酸態(tài)氮的變化Fig.2 Changes of amino acid nitrogen after inoculation with four different aroma-producing yeasts

由圖2可知，隨著發(fā)酵的進行，接種不同菌株的醬醪中氨基酸態(tài)氮無顯著差異，最終氨基酸態(tài)氮都在1.2 g/dL左右，表明這4種酵母對氨基酸態(tài)氮的生成影響有限。

2.3 總酸在發(fā)酵過程中的變化

醬油總酸的主要成分包括氨基酸、乙酸、乳酸等酸類物質，這些酸類物質對醬油品質影響很大。呈味氨基酸會賦予醬油更溫和的鮮味，乙酸、乳酸等酸類能增強醬油的滋味，乙酸、乳酸等還可經酶的作用進一步轉化為酯類、醇類等呈香物質。接種4種不同生香酵母后釀造醬油的總酸變化見圖3。

圖3 分別接種4種生香酵母后總酸的變化Fig.3 Changes of total acid after inoculation with four different aroma-producing yeasts

由圖3可知，發(fā)酵前30天，總酸增長最為迅速，這與氨基酸態(tài)氮的生成量一致，表明發(fā)酵前30天總酸的主要成分為氨基酸。發(fā)酵30天以后，總酸增長較為緩慢，在這一階段主要歸因于乳酸的快速繁殖致使乳酸、乙酸等大量積累。陳伯林的研究顯示，醬醪發(fā)酵前期主要是蛋白酶解及乳酸菌等細菌快速生長階段，隨著醬醪pH降低至5.0～5.5左右，酵母菌開始大量繁殖，菌落群態(tài)的更替引起醬醪中呈味物質的顯著變化[8]。接種不同生香酵母的醬醪總酸差異不大，其中接種酵母菌株CICC 1379的醬醪總酸最低，接種不同酵母菌株引起的總酸含量的細微差異可能是醬醪中微生物菌落群態(tài)發(fā)生改變所致。

2.4 還原糖在發(fā)酵過程中的變化

糖類物質對醬油滋味影響較大。首先，醬油甜味的形成主要歸因于醬油中含有的葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、麥芽糖等，這些糖類是經由米曲霉分泌的酶類水解淀粉類物質和木質纖維素類物質形成的[9]。其次，醬油中糖類物質能經由美拉德反應或者微生物代謝轉化為色素，進而引起醬油風味的變化。分別接種4種生香酵母后還原糖的變化見圖4。

圖4 分別接種4種生香酵母后還原糖的變化Fig.4 Changes of reducing sugar after inoculation with four different aroma-producing yeasts

由圖4可知，在發(fā)酵前30天，還原糖含量呈現(xiàn)顯著的上升趨勢，這是由于米曲霉分泌的淀粉酶、纖維素酶水解原料產生了大量的糖類，同時發(fā)酵前期微生物生長緩慢，產生的糖類物質大于消耗的量，進而引起還原糖含量的顯著上升。圖4結果顯示，接種球擬酵母后醬醪的還原糖含量低于接種魯氏酵母的還原糖含量，這是因為隨著發(fā)酵的進行，醬醪的pH逐漸降低，魯氏酵母耐受pH的能力不如球擬酵母，在發(fā)酵后期，魯氏酵母消亡而球擬酵母仍然能夠生長，較強的菌體活力使得球擬酵母的耗糖能力優(yōu)于魯氏酵母。

2.5 關鍵性呈香物質在發(fā)酵過程中的變化

4-EG和HEMF是醬油中的關鍵性呈香物質，乙醇是生香酵母產生的主要醇類物質。4-EG是由球擬酵母將阿魏酸和4-羥基桂皮酸轉化而得[10]，HEMF則是D-木酮糖-5-磷酸經酵母轉化產生的。分別接種4種生香酵母后90天這些關鍵性呈香物質的變化見圖5。

圖5 接種不同生香酵母產4-乙基愈 創(chuàng)木酚、乙醇和HEMF結果比較Fig.5 Comparison of the content of 4-EG, alcohol and HEMF in soy sauce inoculated with different aroma-producing yeasts

由圖5可知，魯氏酵母CICC 1379所產乙醇含量最高(2.79 g/L)，球擬酵母CICC 1708所產乙醇含量最低(2.13 g/L)。總體而言，接種魯氏酵母的乙醇產量比接種球擬酵母的高。圖5結果顯示，球擬酵母CICC 1708產生4-EG的能力最強，達到1.103 g/L，CICC 1019產生4-EG的能力稍弱，而接種2株魯氏酵母的醬醪4-EG含量最低。王春玲等的研究指出魯氏酵母只產生HEMF不產生4-EG，而研究結果卻發(fā)現(xiàn)單獨接種魯氏酵母后仍有微量4-EG生成，這可能是發(fā)酵過程中引入了野生型酵母或者酵母菌株本身的發(fā)酵特性決定的。同時本研究發(fā)現(xiàn)不論接種魯氏酵母還是球擬酵母醬醪中都會產生HEMF，但是接種魯氏酵母后HEMF的含量更高，其中接種魯氏酵母CICC 1417后醬醪中的HEMF達到0.048 g/L。

2.6 同時接種魯氏酵母和球擬酵母對釀造醬油香氣成分影響

上述結果顯示：球擬酵母和魯氏酵母產生的關鍵性呈香物質存在差異，那么同時接種魯氏酵母和球擬酵母能否強化這些關鍵性呈香物質的合成呢？同時接種不同魯氏酵母和球擬酵母對醬油關鍵性呈香物質的影響見表1。

表1 生香酵母在高鹽(A)和低鹽(B)條件下的生長曲線Table 1 The growth curve of aroma-producing yeasts under high-salt(A) or low-salt(B) condition

注：1為同時接種CICC 1708和CICC 1417；2為同時接種CICC 1708和CICC 1379；3為同時接種CICC 1019和CICC 1417；4為同時接種CICC 1019和CICC 1379。

由表1可知，同時接種魯氏酵母和球擬酵母組合方式，4-EG和HEMF含量都得到不同程度的提高：同時接種CICC 1708和CICC 1417后4-EG和HEMF含量最高，分別達到1.26,0.063 g/L，較單獨接種魯氏酵母或球擬酵母效果好。同時接種魯氏酵母和球擬酵母后，乙醇含量也較單獨接種強，其中接種CICC 1019和CICC 1379后乙醇含量最高，達到3.35 g/L。有研究表明魯氏酵母和球擬酵母存在拮抗效應[11]，拮抗效應的存在可能最終影響醬油風味物質的形成，但是對于風味物質的影響仍然缺乏研究。本研究通過不同魯氏酵母和球擬酵母的組合接種，探究對關鍵性呈香物質形成的影響，這對提升醬油品質具有重要的理論指導意義。

3 結論

通過單獨或組合接種2株魯氏酵母和2株球擬酵母的方式，深入考察了魯氏酵母和球擬酵母對釀造醬油品質的影響。發(fā)現(xiàn)組合接種魯氏酵母和球擬酵母的方式優(yōu)于單獨接種魯氏酵母或球擬酵母，其中同時接種CICC 1708和CICC 1417后4-EG和HEMF含量最高，分別達到1.26，0.063 g/L。本研究深入揭示了魯氏酵母和球擬酵母對醬油關鍵性指標的影響，為提升醬油品質提供了指導。