鉬藍(lán)比色法測定特菜中還原型維C含量的研究

柳 青，劉繼偉，黃廣學(xué)，汪慧華，馬長路，趙 婷

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京 102442）

“特菜”指從國外和國內(nèi)各地引進(jìn)的名、特、優(yōu)、新品種的蔬菜總稱，通常具有“外形特、顏色特、營養(yǎng)特”三大特點(diǎn)[1]，富含人體必需的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、有機(jī)物、膳食纖維和微量元素等，同時又具有一定特殊功能的蔬菜，是一種“藥食同源”的功能性保健食品[2]。現(xiàn)今盛行的特菜品種有百利番茄、水果黃瓜、佛手瓜、美國苦苣、櫻桃番茄、彩色甜椒、紫背天葵、羽衣甘蘭、香芹、京水菜、烏塌菜等。特菜營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，其中還原型維C含量是果蔬主要的品質(zhì)指標(biāo)，是維持人體正常生理代謝必不可少的一類有機(jī)化合物[3]。食品中還原型維C的測定方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法、2,6-二氯靛酚滴定法、熒光分析法（OPDA）等[4-6]。鉬藍(lán)法是指食品中的還原型維C將磷鉬酸鹽還原成藍(lán)色絡(luò)合物，通過比色的方法測出樣品中還原型維C含量的一種方法[7]，它具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，且不受蔬菜顏色的影響[8]。以冰菜、直立生菜、羅馬生菜、芝麻菜、費(fèi)菜、紅橡生菜6種特菜為研究對象，對其維C的含量進(jìn)行測定，以最大吸收峰、酸性介質(zhì)、pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間等因素作為試驗(yàn)進(jìn)一步研究的條件，以此確定鉬藍(lán)比色法測定食品中還原型維C的最佳試驗(yàn)條件，同時為特菜的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論參考。

測定原理：在酸性介質(zhì)中偏磷酸和磷鉬酸鹽反應(yīng)生成磷鉬酸，并被還原型維C還原成的鉬藍(lán)化合物?；瘜W(xué)反應(yīng)如下：

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮直立生菜、紅橡生菜、羅馬生菜、冰菜、芝麻菜、費(fèi)菜，均采自北京市大興區(qū)安定鎮(zhèn)勤勵園恒昌種植有限公司；普通生菜，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

HR2095/30型攪拌榨汁機(jī)，飛利浦投資有限公司產(chǎn)品；T6型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；FA1104N型電子分析天平。

1.3 試劑

①5%的鉬酸銨溶液：準(zhǔn)確稱取鉬酸銨25.000 0 g，加適量蒸餾水定容至500 mL容量瓶；②草酸-EDTA溶液：精確稱取含結(jié)晶水的草酸6.300 0 g，EDTA 0.058 4 g，充分溶解定容至1 000 mL容量瓶；③5%的硫酸溶液：吸取5.00 mL的濃硫酸稀釋至100 mL容量瓶；④偏磷酸-醋酸溶液：稱取15.000 0 g片狀偏磷酸于40 mL醋酸中，稀釋至500 mL容量瓶，用濾紙過濾，取濾液備用；⑤標(biāo)準(zhǔn)維C溶液：準(zhǔn)確稱取抗壞血酸（維C） 0.100 0 g，用配好的草酸-EDTA溶液定容于100 mL容量瓶中，使標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液，再加入草酸-EDTA溶液，使總體積達(dá)到10 mL；緊接著加入1.00 mL的偏磷酸-醋酸溶液，5%硫酸溶液2.00 mL和5%鉬酸銨溶液4.00 mL，以蒸餾水定容于50 mL的容量瓶中，搖勻，靜置15 min，以試劑空白為參照，于波長709 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 樣品測定

準(zhǔn)確稱取紅橡生菜、芝麻菜、冰菜、直立生菜、費(fèi)菜、羅馬生菜各50 g，分別加入適量草酸-EDTA溶液，經(jīng)攪碎后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中定容、過濾。吸取上清液為待測的樣品的提取液。

分別吸取各蔬菜的提取液10 mL于50 mL容量瓶中，加入1.00 mL的偏磷酸-醋酸溶液，5%硫酸溶液2.00 mL和5%鉬酸銨溶液4.00 mL，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15 min，于波長709 nm處測定吸光度。

1.4.3 樣品中還原型維C含量的計(jì)算

根據(jù)樣液吸光度，計(jì)算各蔬菜樣品中的還原型維C的含量：

式中：C——測定用樣液中還原型維C的含量，mg；

V1——樣液定容總體積，mL；

V2——測定用樣液體積，mL；

W——樣品重量，g。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin軟件制圖，并用Spss軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收峰的確定

維C在500～900 nm標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收曲線見圖1。

圖1 維C在500～900 nm標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收曲線

圖1 表示在500～900 nm范圍內(nèi)維C標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收曲線，分別吸取0.2 mL（紅），0.5 mL（綠），0.8 mL（墨綠），1.0 mL（紫） 的維C標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)15 min顯色后在波長500～900 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，在709 nm處有最大吸收峰，因此試驗(yàn)選取709 nm為測定波長。

2.2 鉬酸鹽用量對吸光度的影響

鉬酸鹽用量對吸光度的影響見圖2。

圖2 鉬酸鹽用量對吸光度的影響

圖2 為鉬酸鹽用量對吸光度影響的曲線，在酸性介質(zhì)中，磷酸鹽與鉬酸銨反應(yīng)，在銻鹽存在下生成磷雜多酸，便于進(jìn)一步比色分析[9]。結(jié)果表明，隨著鉬酸鹽用量的增加，吸光度增加，在4.00 mL左右達(dá)到最大值。因此選用5%鉬酸銨溶液4.00 mL作為試驗(yàn)的反應(yīng)條件。

2.3 酸性介質(zhì)的選擇

硫酸用量對吸光度的影響見圖3。

圖3 硫酸用量對吸光度的影響

由于維C具有較強(qiáng)的還原性，在空氣中極易被氧化而變成黃色，尤其在堿性介質(zhì)中更甚，測定時加入硫酸溶液使溶液呈弱酸性，以減少維C的副反應(yīng)[10]。分別吸取0.5 mL的維C標(biāo)準(zhǔn)溶液，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，加入適量草酸-EDTA溶液，使總體積達(dá)到10 mL，再分別加入5%硫酸1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0 mL，于波長709 nm的條件下用1 mL的比色皿測定。由圖3可知，硫酸用量在2.00～6.00 mL，有最大吸光度，因此選用l5%硫酸2.00 mL進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4 偏磷酸-醋酸用量對吸光度的影響

偏磷酸-醋酸用量對吸光度的影響見圖4。

圖4 偏磷酸-醋酸用量對吸光度的影響

偏磷酸和磷鉬酸鹽在酸性介質(zhì)中生成磷鉬酸，并被還原型維C還原成亮藍(lán)色的鉬藍(lán)化合物[11]。由圖4可知，隨著偏磷酸-醋酸溶液用量的增加，吸光度的大小也發(fā)生相應(yīng)的變化，變化趨勢為先增大后趨于平穩(wěn)最后緩慢下降，在用量達(dá)到1.00 mL后達(dá)到最大值并保持穩(wěn)定，因此選用1.00 mL的偏磷酸-醋酸溶液作為試驗(yàn)進(jìn)行的條件。

2.5 顯色時間的選擇

顯色時間對吸光度的影響見圖5。

由圖5可知，該體系在草酸-EDTA溶液介質(zhì)中于室溫下反應(yīng)15 min后達(dá)到穩(wěn)定，滿足測定時間的要求，因此選室溫下的顯色時間15 min進(jìn)行測定。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

于波長709 nm條件下維C的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。

圖6 于波長709 nm條件下維C的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以維C標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出維C溶液質(zhì)量濃度與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線型關(guān)系，維C溶液質(zhì)量濃度在0～1.4 mg/mL范圍內(nèi)服從比爾定律，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.392 2X-0.005 7，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 6。

2.7 特菜中維C的測定

通過試驗(yàn)，確定了鉬藍(lán)比色法測定蔬菜中還原型維C的最佳條件。在上述試驗(yàn)的測得條件下，測得6種特菜的維C含量，并以普通蔬菜為對照組進(jìn)行顯著性分析。

6種特菜中維C含量的比較分析見表1。

表1 6種特菜中維C含量的比較分析

由表1可知，普通生菜維C含量為12.15 mg/100 g，所測生菜的維C含量均高于普通生菜，直立生菜、紅橡生菜、芝麻菜、冰菜、羅馬生菜、費(fèi)菜維C含量均與普通生菜存在顯著性差異（p＜0.05），其中芝麻菜維C的含量最高，含量為95.62 mg/100 g；其次是羅馬生菜和紅橡生菜，維C含量分別為21.74 mg/100 g和21.29 mg/100 g，第三是直立生菜，維C含量為15.57 mg/100 g，費(fèi)菜維C含量最低為13.71 mg/100 g。而在各種特菜維C含量差異的比較中，直立生菜、冰菜與費(fèi)菜之間無顯著性差異。

3 結(jié)論

采用鉬藍(lán)比色法測定特菜中還原型維C的含量，通過單因素試驗(yàn)確定了鉬藍(lán)比色法測定特菜的最佳反應(yīng)條件為測定波長709 nm，偏磷酸-醋酸溶液1.00 mL，5%硫酸溶液2.00 mL，5%鉬酸銨溶液4.00 mL，從而確立了一種簡便、快速的測定還原型維C的方法。

利用鉬藍(lán)法對6種特菜中的維C進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，直立生菜、紅橡生菜、芝麻菜、冰菜、羅馬生菜、費(fèi)菜均與普通生菜維C含量存在顯著性差異（p＜0.05），均高于市售普通生菜。其中，維C最高的為芝麻菜，含量為95.62 mg/100 g；其次是羅馬生菜和紅橡生菜，維C的含量分別為21.74 mg/100 g和21.29 mg/100 g，第三是直立生菜，維C的含量為15.57 mg/100 g。

維生素是人體生命活動所需的一種有機(jī)化合物，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和體內(nèi)正常的生命活動代謝，缺乏維C可導(dǎo)致壞血病，對細(xì)胞膜的氧化損傷起到修復(fù)作用，在體內(nèi)起到抗氧化的作用[12]。通過新鮮食物攝入以滿足人類日常生命活動的需求的維C是最健康的方式，試驗(yàn)中6種蔬菜所含的維C含量是普通生菜的1.1～7.8倍，在日常生活中可多吃特菜以補(bǔ)充人體中的維C[13]。