細(xì)胞外囊泡在肝細(xì)胞癌及膽管癌診治中的作用研究進(jìn)展

解飛虎，馮時(shí)，孫樂(lè)家，毛一雷

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院 肝臟外科，北京 100730）

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是細(xì)胞旁分泌產(chǎn)生的亞細(xì)胞成分，由脂質(zhì)雙分子層包裹形成球形囊泡，內(nèi)含豐富的核酸、脂質(zhì)、蛋白等，參與細(xì)胞間的物質(zhì)交換和信息交流。依據(jù)其產(chǎn)生來(lái)源和生物學(xué)特點(diǎn)又分為外泌體、微囊泡和凋亡小體，其中關(guān)于外泌體的研究較為廣泛，微囊泡次之[1]。EVs最初被認(rèn)為是細(xì)胞排泄代謝產(chǎn)物的一種細(xì)胞結(jié)構(gòu)，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)EVs參與機(jī)體內(nèi)眾多的生理、病理活動(dòng)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)EVs是腫瘤細(xì)胞與靶細(xì)胞信息交流的重要方式，能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)能力[2-3]。EVs攜帶來(lái)源腫瘤細(xì)胞內(nèi)特定的核酸、蛋白等分子物質(zhì)，具有很強(qiáng)的腫瘤特異性，有望成為新型分子標(biāo)志物用于良惡性疾病診斷和預(yù)后判斷等，其球形載體的特殊結(jié)構(gòu)，同時(shí)也是良好的新藥研發(fā)工具[2-5]。肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular cancer，HCC）是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝腫瘤，因缺乏早期典型的臨床表現(xiàn)，很多肝癌患者在確診時(shí)已喪失根治性切除機(jī)會(huì)。對(duì)于晚期肝癌患者，介入栓塞、靶向治療以及化療等只能有限延長(zhǎng)患者的生存期[6-7]。膽管癌（cholangiocarcinoma）約占消化道腫瘤的3%，同樣由于缺乏早期的臨床表現(xiàn)，膽管癌的早期診斷和根治性手術(shù)切除率亦較低[7-8]。新近研究發(fā)現(xiàn)EVs在肝細(xì)胞癌和膽管癌的發(fā)生發(fā)展中扮演十分關(guān)鍵的角色，在腫瘤的診斷和相關(guān)治療中具有巨大的臨床應(yīng)用前景[1-3]。本文就EVs在肝細(xì)胞癌和膽管癌的診斷及治療中的研究進(jìn)展做一綜述。

1 肝臟來(lái)源的EVs及其生理特點(diǎn)

肝臟是多細(xì)胞實(shí)質(zhì)性臟器，由肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞，和Kupffer細(xì)胞等免疫細(xì)胞組成[9]。肝臟發(fā)揮正常生理功能有賴于肝內(nèi)細(xì)胞之間的物質(zhì)交換和信息交流。除了自分泌、旁分泌和細(xì)胞間直接接觸等信息交流方式外，肝細(xì)胞來(lái)源的EVs是肝內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要載體。在體外實(shí)驗(yàn)中，大多數(shù)上述肝內(nèi)的細(xì)胞都可以分泌EVs。不同細(xì)胞分泌的EVs有著不同的功能，如來(lái)自肝細(xì)胞的EVs能調(diào)節(jié)自身的增殖，來(lái)自肝星狀細(xì)胞的EVs參與肝纖維化的形成[10]。在細(xì)胞受刺激或在疾病狀態(tài)下，肝細(xì)胞分泌的外泌體及微囊泡會(huì)發(fā)生明顯量和質(zhì)的改變，囊泡內(nèi)蛋白及核酸的構(gòu)成也會(huì)發(fā)生改變[11]。

膽汁由肝細(xì)胞合成后流經(jīng)膽道進(jìn)行排泄，收集肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞及各種免疫細(xì)胞分泌的EVs。膽汁中EVs中含有豐富的miRNA、Inc-RNA和蛋白等，參與膽道內(nèi)正常微環(huán)境的調(diào)節(jié)[12]。Masyuk等[13]在研究膽汁中EVs生理特點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，膽汁EVs可粘附于膽管上皮細(xì)胞纖毛，通過(guò)降低磷酸化的ERK1/2的比例和促進(jìn)miR-15a的表達(dá)，抑制膽管細(xì)胞的增殖。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)雞膽汁EVs可促進(jìn)CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖和肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的活化，參與免疫應(yīng)答。Severino等[15]發(fā)現(xiàn)膽管癌及胰腺癌患者膽汁EVs濃度明顯升高，依據(jù)膽汁中EVs濃度鑒別良惡性膽道疾病及胰腺疾病具有非常好的靈敏度和特異性。

在肝硬化的發(fā)生過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞是分泌大量不溶性膠原促進(jìn)纖維化形成的主要效應(yīng)細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞的活化是肝硬化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)在肝星狀細(xì)胞活化過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞分泌的EVs中扭曲基因相關(guān)蛋白1（TWIST1）的含量明顯下降，降低了miR-214的表達(dá)，間接促進(jìn)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子2（connective tissue growth factor 2，CCN2）的合成，而后者是CCN2依賴性纖維化過(guò)程的核心物質(zhì)。Charrier等[17]發(fā)現(xiàn)活化后的肝星狀細(xì)胞可以將CCN2打包到EVs中，EVs將CCN2轉(zhuǎn)運(yùn)至其他靜止期或活化后的肝星狀細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。

2 EVs在肝細(xì)胞癌和膽管癌中的診斷價(jià)值

與非腫瘤細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞分泌EVs的濃度及其內(nèi)容物成分迥異。有學(xué)者在對(duì)卵巢癌和肺癌細(xì)胞EVs中的RNA成分進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，其與非腫瘤細(xì)胞EVs中的miRNA種類明顯不同，可以作為卵巢癌及肺癌的診斷性的生物標(biāo)志物[18-19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者血清EVs濃度明顯升高，利用血清中多糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（glypican-1，GPC-1）表達(dá)陽(yáng)性的EVs可以準(zhǔn)確的區(qū)分胰腺癌和良性胰腺病變，并且GPC-1陽(yáng)性的EVs濃度和胰腺癌患者生存期相關(guān)[20]。

2.1 EVs在肝細(xì)胞癌中的診斷價(jià)值

肝細(xì)胞癌患者多無(wú)明顯的臨床表現(xiàn)，挖掘潛在的生物標(biāo)志物一直是肝癌診療領(lǐng)域的一個(gè)重要議題。Valadi等[21]在2007年首次研究發(fā)現(xiàn)外泌體可攜帶mRNA和miRNA至其他細(xì)胞，并在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出相應(yīng)蛋白產(chǎn)物。而后大量的證據(jù)表明腫瘤細(xì)胞EVs包含多種類型的RNA，具有很好的腫瘤特異性，可以作為潛在的生物標(biāo)志物[22-25]。

成熟EVs miRNA約占總EVs RNA的40%以上[3]。體外實(shí)驗(yàn)中肝癌細(xì)胞來(lái)源的EVs包含多種miRNA，如miR-584，miR-517c，miR-378等[21]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中肝癌細(xì)胞EVs miRNA包括miR-10b、miR-21和miR-718等[22]。Sohn等[23]研究發(fā)現(xiàn)與乙肝及肝硬化患者相比，肝癌患者血清多種EVs miRNA明顯升高，包括miR-18a，miR-221，miR-222和miR-224等，而miR-101，miR-106b，miR-122和miR-195則低于前兩者。Sugimachi等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與肝移植術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)的肝癌患者相比，術(shù)后復(fù)發(fā)患者的血清EVs miR-718的表達(dá)明顯下降，mi-R718的下降水平與肝癌細(xì)胞的侵襲性相關(guān)。Wang等[25]研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者的血清EVs miR-21的表達(dá)水平較健康人群及慢性乙型肝炎患者明顯升高，且miR-21的高表達(dá)和患者的肝硬化程度和腫瘤分期相關(guān)。

2.2 EVs在膽管癌中的診斷價(jià)值

Severino等[15]研究發(fā)現(xiàn)膽管癌和胰腺癌患者膽汁EVs濃度明顯升高，是膽管結(jié)石和慢性胰腺炎的患者膽汁EVs濃度的10倍左右，依據(jù)膽汁EVs濃度進(jìn)行膽管癌與膽管結(jié)石、胰腺癌和慢性胰腺炎的診斷實(shí)驗(yàn)，診斷準(zhǔn)確性可達(dá)到100%。該研究結(jié)果提示依據(jù)膽汁EVs濃度進(jìn)行良惡性膽道梗阻的診斷效能明顯優(yōu)于血清CA19-9。Arbelaiz等[26]研究發(fā)現(xiàn)膽管癌、原發(fā)性硬化性膽管炎及肝細(xì)胞癌患者血清EVs濃度無(wú)明顯差異，但EVs內(nèi)包含的多種蛋白具有很高的診斷價(jià)值。與原發(fā)性硬化性膽管炎及肝細(xì)胞癌患者相比，膽管癌患者血清EVs C-反應(yīng)蛋白、ficolin-2、纖維蛋白原γ鏈和血漿蛋白酶C1抑制劑等分泌水平更高，其中ficolin-2、血漿蛋白酶C1抑制劑等在早期膽管癌（I～I(xiàn)I期）患者血清中明顯升高，具有比血清CA19-9更高的診斷價(jià)值。Li等[27]研究發(fā)現(xiàn)人膽汁中含有了豐富的miRNA，與原發(fā)性硬化性膽管炎、慢性胰腺炎等良性疾病相比，膽管癌患者膽汁EVs中多種RNA（miR-191，miR-486-3p，miR-1274b）表達(dá)上調(diào)，用于診斷膽管癌具有良好的靈敏度和特異性。

3 EVs在肝細(xì)胞癌和膽管癌中的治療價(jià)值

3.1 EVs在肝細(xì)胞癌中的治療價(jià)值

EVs可作為攜帶miRNA的載體，在肝細(xì)胞癌的基因靶向治療中有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。Wei等[28]研究發(fā)現(xiàn)，Vps4A可通過(guò)抑制PI3K/Akt通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞內(nèi)抑癌性miRNA的累積，抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)展。而在肝癌細(xì)胞內(nèi)及其EVs中，Vps4A的表達(dá)水平很低，通過(guò)提高EVs Vps4A的表達(dá)有可能達(dá)到抗腫瘤的治療目的。Lou等[29]研究發(fā)現(xiàn)，用miR-122轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EVs，將轉(zhuǎn)染后的Evs添加到肝癌細(xì)胞培養(yǎng)基中，可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞周期G0/G1停滯和細(xì)胞凋亡。在腫瘤內(nèi)部注射轉(zhuǎn)染后的EVs，可以增強(qiáng)索拉菲尼的抗肝癌療效。

在一項(xiàng)小鼠肝癌模型的實(shí)驗(yàn)中，研究者將體外培養(yǎng)的H22肝癌細(xì)胞置于甲氨蝶呤等化療藥物和紫外線照射下，細(xì)胞相繼發(fā)生死亡后獲得攜帶化療藥物的微囊泡。然后在培養(yǎng)基中分別直接應(yīng)用游離的甲氨蝶呤和微囊泡攜帶的相同劑量的甲氨蝶呤分別造成了2%和23%的細(xì)胞死亡。攝取了“毒性”微囊泡后的腫瘤細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步分泌具有細(xì)胞毒性的囊泡，產(chǎn)生一種多米諾效應(yīng)式的細(xì)胞殺傷作用。微囊泡攜帶的甲氨蝶呤在抑制腫瘤生長(zhǎng)和延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間上較游離甲氨蝶呤更為有效[30]。

3.2 EVs在膽管癌中的治療價(jià)值

Li等[31]研究發(fā)現(xiàn)膽管癌細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞微環(huán)境中miR-195表達(dá)均下調(diào)，用miR-195轉(zhuǎn)染成纖維母細(xì)胞來(lái)源的EVs，轉(zhuǎn)染后的EVs被膽管癌細(xì)胞攝取后在腫瘤內(nèi)富集，可以縮小腫瘤體積，并延長(zhǎng)小鼠腫瘤模型的生存時(shí)間。

4 總結(jié)與展望

近十年來(lái)關(guān)于EVs的研究有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，EVs能夠直接反應(yīng)來(lái)源組織細(xì)胞的代謝狀態(tài)和生物學(xué)特性，能夠攜帶來(lái)源組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸、蛋白等物質(zhì)，腫瘤特異性極強(qiáng)，有望成為全新的生物分子標(biāo)志物用于疾病的診斷和預(yù)后判斷。EVs還可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和攜帶核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)至靶細(xì)胞、靶器官，起到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，可能成為新型的抗腫瘤治療方式?，F(xiàn)階段尚有一些亟待解決的問(wèn)題：EVs的合成、分泌、參與信息交流等過(guò)程的分子機(jī)制尚不明確；EVs的亞群的種類、特性需要更深入的研究；缺乏大量制備、分離、純化及保存EVs的標(biāo)準(zhǔn)方案、方法等。關(guān)于EVs在腫瘤的發(fā)病及診療中潛在應(yīng)用價(jià)值的研究尚處于起始階段，相關(guān)研究有限，相信在不久的將來(lái)，EVs將在腫瘤早期診斷和治療具有廣闊前景。