人工老化對老芒麥種子生理生化特性及醇溶蛋白組成的影響

孫守江，祁 娟，金 鑫，吳召林，何麗娟，陳永崗，王 波，師尚禮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要資料，種子收獲后保存、儲藏過程中內(nèi)部的各種物質(zhì)不斷的被消耗，因此，種子在儲藏過程中隨著儲藏年限的增加活力不斷降低，不可避免的出現(xiàn)老化現(xiàn)象[1-2]。因此，需采取外界措施延緩種子代謝過程，減少重要物質(zhì)的丟失。種子內(nèi)部無休止的發(fā)生著一系列的生理生化反應，貯藏環(huán)境不良將導致大量活性氧積累，進而引起一系列的生理生化特性變化，如抗氧化酶活性降低、細胞膜脂被氧化、細胞膜透性變大、代謝產(chǎn)物外滲，而較高濃度的活性氧對細胞遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)造成氧化損傷[3]。因此，貯藏環(huán)境直接影響著種子的遺傳物質(zhì)、貯藏物質(zhì)，反應產(chǎn)物同時也影響細胞的結構，種子內(nèi)部各種酶的活性進一步又反饋調(diào)節(jié)生理生化反應的速度[4]。隨著對種子老化研究的深入，許多學者開始運用人工加速種子老化的方法，通過對老化種子活力及生理生化變化的研究，找出活力下降的原因和某些生理生化特性的變化規(guī)律，進一步探討種子老化的機理。人工加速種子老化是在人為條件下對種子進行加速老化處理使種子活力迅速喪失的過程[5]，可在短時間內(nèi)研究在自然條件下需要很長時間才能產(chǎn)生的劣變過程，是研究種子劣變規(guī)律的有效途徑[6]。利用人工老化法使種子活力迅速喪失，可模擬種子的自然老化和劣變過程[7]。劉霞[8]、孫春青[9]、曾欽薇等[10]采用人工加速老化方法，分別研究了辣椒種萼香茶菜種子、2個玉米自交系(Mo17、478)種子、茶葉籽、垂穗披堿草種子、越冬甘藍品種‘冬升’種子、油菜種子老化過程中發(fā)生的一系列生理變化。吳浩等[11]采用人工種子老化的方法制得不同活力的垂穗披堿草種子，研究了垂穗披堿草種子活力及其與酶和貯藏蛋白的關系，研究發(fā)現(xiàn)，人工老化不僅對種子的活力以及生理生化特性有影響，還對種子內(nèi)部的貯藏蛋白質(zhì)也有影響。

醇溶蛋白作為種子儲藏蛋白的一部分，在種子活力的維持方面發(fā)揮著重要作用[11]，為種子萌發(fā)初期提供必需的結構物質(zhì)，使得種子正常發(fā)芽。在發(fā)育過程中，其組成不受自身以及周圍直接接觸環(huán)境的影響，其電泳譜帶特征全部受到對應的遺傳物質(zhì)調(diào)控[12]，因此，可以通過觀察電泳譜帶了解相關基因的特異性表達情況，探討人工老化對醇溶蛋白組成的影響。

老芒麥(Elymussibiricus)是禾本科披堿草屬多年生草本植物，在中國廣泛種植[13]。老芒麥種子作為中國北方地區(qū)主要的栽培及生態(tài)建設使用草種之一[14]，其種子產(chǎn)量高低尤其是種子質(zhì)量優(yōu)劣受到生產(chǎn)者以及經(jīng)營者的高度關注[15]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、人工草地建植以及天然草地恢復中經(jīng)常會用到已存放很久的種子，前期種子存放不當會使種子的萌發(fā)力下降，在田地種植以后導致出苗不佳，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及人工草地建植造成損失[16]?；诖?，以老芒麥種子為材料，研究人工老化處理后種子的生理生化變化，并采用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳法(A-PAGE)對不同老化程度種子醇溶蛋白進行分析，以期為評價種子的品質(zhì)好壞提供理論依據(jù)，為延緩種子老化過程提供參考資料，也對老芒麥資源的進一步開發(fā)利用具有積極的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為‘青牧1號’老芒麥(Elymussibiricus)種子，2015年9月10日采集于青海省畜牧獸醫(yī)科學院海北州海晏縣西海鎮(zhèn)牧草種子擴繁試驗基地，該基地位于E 100°23′，N 36°44′，海拔3 010 m。收集的‘青牧1號’老芒麥種子用布種子袋分裝，室溫貯藏于青海省畜牧獸醫(yī)科學院牧草種子庫中。試驗于2017年10～12月在甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院實驗室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 老芒麥種子老化處理方法 隨機選取供試種子，參照國際種子檢驗協(xié)會提供的種子老化方法[19]，用種子老化箱IH-150S對種子處理，即在45℃，100%相對濕度條件下進行人工老化處理。老化處理時間分別為0(對照CK)、1、2、3、4、5、6和7 d，以不處理的種子為對照。老化后的種子隨機取出在室溫條件下晾干(3～4 d)[20]，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生理生化指標測定 種子浸出液電導率測定參照國際種子檢驗協(xié)會《種子活力測定方法手冊》有關電導率測定方法，用DDSJ-308A電導儀測定浸出液電導率[μs/(cm·g)][23]，隨機選取老化處理后的飽滿種子50粒，重復3次，稱量后放入100 mL去離子水中，設置對照(100 mL去離子水)，加蓋在20℃恒溫培養(yǎng)箱中放置24 h；丙二醛(MDA)含量的測定參考文獻[20]的方法；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[20]；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用NBT光還原法[29]；可溶性糖含量的測定用蒽酮法測定[20]；可溶性蛋白含量測定用考馬斯亮藍G-250染色法[20]。

1.2.3 醇溶蛋白提取及酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)分析 醇溶蛋白的分離鑒定采用國際種子檢驗協(xié)會(ISTA)頒布的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE) (pH 3.12)標準程序[25]，并加以改進。醇溶蛋白提取液：依次吸取25 mL 2-氯乙醇、5 mL丙三醇，用蒸餾水定容至100 mL，低溫保存；電極緩沖液，取4 mL冰醋酸，加入0.4 g甘氨酸，用蒸餾水定容至1 L，低溫保存；凝膠緩沖液，1.0 g 氨基乙酸(Glycine)，60 g尿素，1.0 g抗壞血酸，硫酸亞鐵0.05 g，20 mL冰醋酸，用蒸餾水定容至1 L；凝膠溶液：17.55 g丙烯酰胺，0.45 g亞甲基丙烯酰胺，用凝膠緩沖液溶解并定容至100 mL；0.6%過氧化氫液：取2 mL 30%過氧化氫，用蒸餾水定容至100 mL；10%三氯醋酸液，取50.0 g三氯醋酸，用蒸餾水定容至500 mL；1%考馬斯亮藍液：取0.5 g考馬斯亮藍R-250，用無水乙醇溶解并定容至50 mL；甲基綠指示劑，取0.05 g甲基綠，用蒸餾水溶解并定容至100 mL。

醇溶蛋白提?。好糠莶牧先?粒，去芒剝皮研成粉末后轉入1.5 mL離心管中，加入1 mL醇溶蛋白提取液，搖床震蕩提取1 h，室溫下浸提過夜，8 000 r/min離心5 min，將上清液轉入新的1.5 mL離心管中，并加入30 μL甲基綠指示劑，混勻后染色30 min立刻上樣或于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

電泳檢測：(1)灌膠 吸取30 mL凝膠溶液，加入46 μL 0.6%過氧化氫溶液，迅速搖勻后倒入凝膠玻璃板之間，插入樣品梳，靜置至凝膠完全聚合；(2)待凝膠完全聚合后，小心取出樣品梳，用電極緩沖液沖洗加樣孔，每個樣品加樣量為10 μL；(3)電泳在冰盒中進行，上下電泳槽中加入電極緩沖液800 mL，先100V預電泳10 min，待樣品全部進入膠板后，電壓調(diào)至300 V，電泳110 min；(4)電泳結束后，待玻璃板完全冷卻至室溫，取下凹型玻璃板，每塊膠板取200 mL 10%三氯醋酸并加入10 mL 1%考馬斯亮藍液混勻，固定染色12 h后用蒸餾水沖洗干凈并拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，Microsoft Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)并繪圖，所有數(shù)據(jù)均為3個重復的平均值±標準誤(±SE)。

2 結果與分析

2.1 人工老化對老芒麥種子生理生化特性的影響

2.1.1 人工老化對老芒麥種子浸出液電導率和MDA含量的影響 隨著人工老化程度的加劇，種子浸出液電導率和MDA含量都呈現(xiàn)出一個逐漸增加的趨勢。老化7 d后，種子浸出液電導率與對照相比差異顯著(P<0.05)，增幅為13.9%；老化1～4 d處理間差異不顯著(P>0.05)，5～7 d處理間差異顯著(P<0.05)(圖1)。人工老化處理顯著增加了脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物MDA的含量。隨老化時間的延長，人工老化1～3 d，MDA含量緩慢上升，老化處理3 d后MDA含量開始顯著增加，增幅為109.21%，第7 d達最大值，與對照相比，MDA含量增加54.97 μmol/g(圖2)。

圖1 人工老化處理下老芒麥的電導率Fig.1 Changes of conductivity in Elymus sibiricusafter artificial aging treatment注：圖中不同字母表示不同老化時間之間差異顯著(P<0.05),下同

2.1.2 人工老化對老芒麥種子可溶性蛋白和可溶性糖的影響 隨著老化時間的延長，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。與對照相比，老化1 d后可溶性蛋白含量增加2.43 mg/g，隨著老化程度的進一步加劇，可溶性蛋白含量開始緩慢降低，老化3 d后，可溶性蛋白含量急劇下降，通過顯著性分析可以看出，不同處理之間差異顯著(P<0.05)，老化7 d后，可溶性蛋白含量與對照相比下降了11.89 mg/g(圖3)。老化處理后，與對照相比，可溶性糖含量增加，增幅為79.05%，但是各處理之間差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

圖2 人工老化處理下老芒麥的MDA含量Fig.2 Changes of malondialdehyde content in Elymus sibiricus after artificial aging treatment

圖3 人工老化處理下老芒麥的可溶性蛋白含量Fig.3 Changes of soluble protein content in Elymus sibiricusafter artificial aging treatment

2.1.3 人工老化對老芒麥種子SOD和POD活性的影響 隨著老化程度的加劇，SOD活性呈明顯下降趨勢，第7 d下降至最低點，與對照相比，SOD活性下降了44.49%，不同處理的老芒麥種子SOD活性與對照相比差異均顯著(P<0.05)(圖5)。隨著老化程度的加劇，POD活性同樣呈現(xiàn)出下降趨勢，老化初期，下降較平緩，老化處理2 d后，POD活性顯著降低，老化處理第7 d下降至最低點，與對照相比，活性下降了32.62%。不同處理與對照相比差異均顯著(P<0.05)(圖6)。處理相同天數(shù)，SOD活性下降程度大于POD活性下降程度(44.49%>32.62%)。

圖4 人工老化處理后老芒麥的可溶性糖含量Fig.4 Changes of soluble sugar content in Elymus sibiricus after artificial aging treatment

圖5 人工老化處理老芒麥的SOD活性Fig.5 Changes of SOD activity in Elymus sibiricus after artificial aging treatment

圖6 人工老化處理后老芒麥的POD活性Fig.6 Changes of POD activity in Elymus sibiricus after artificial aging treatment

2.2 人工老化對老芒麥種子醇溶蛋白組成的影響

處理0～2 d的條帶最多，為16條，3～5 d的條帶最少，為9條。參照Woychick J H等[32]的方法，根據(jù)遷移率大小將電泳譜帶分為α、β、γ 和ω 4個區(qū)，不同老化程度的種子在各個分區(qū)中出現(xiàn)的譜帶數(shù)目有所不同(表1)。當人工老化4 d以后，醇溶蛋白圖譜顏色逐漸變淺，且隨著人工老化時間進一步延長，α、β、γ 和ω4個區(qū)的醇溶蛋白譜帶表現(xiàn)為缺失或消失(圖7)。

圖7 醇溶蛋白電泳圖譜Fig.7 Electrophoretogram of gliadin under different aging treatments注：1,2,3,4,5,6,7表示不同的老化天數(shù)；CK表示未老化的種子

老化天數(shù)/d總譜帶數(shù)分區(qū)譜帶數(shù)αβγω0(CK)1653531165353216535339422149422159422161042317104231

3 討論

3.1 人工老化對老芒麥種子生理生化特性的影響

種子收獲后在合適的環(huán)境下可以貯藏，但是隨著貯藏條件不佳以及貯藏時間的延長，種子將會不斷的劣變，種子老化將不可避免、不可逆轉的發(fā)生。種子老化或者劣變是一個逐步發(fā)生并且涉及眾多復雜生理生化反應的過程，老化過程中表現(xiàn)出抗氧化酶活性逐漸降低、細胞膜脂被氧化、細胞膜透性變大、代謝產(chǎn)物外滲等，人工老化是模擬自然老化的過程[17]。

MDA 通常作為膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，此含量的高低可以用來衡量植物處在逆境脅迫下細胞膜受損的程度[29]。試驗中隨老化程度的加劇，種子的MDA含量逐漸升高，這與Zhang M等[29]在玉米種子人工老化研究中的結果一致，說明人工老化處理加速了細胞膜的受損程度。隨著老化時間的延長，種子浸出液電導率逐漸升高，說明細胞膜破壞越來越嚴重。

可溶性糖是種子光合作用前的底物，能反應呼吸底物的喪失，也能反應種子在老化中的損傷程度以及種子活力的高低[28]。隨著老化程度的加重，老芒麥種子的可溶性糖含量逐漸增加，這與Kalpana[26]和浦心春等[28]的研究結果相似，說明隨著老化程度的加劇，細胞膜結構可能受到破壞?？扇苄缘鞍鬃鳛橐环N重要的細胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物適應逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，隨著老化時間的延長，老芒麥種子的可溶性蛋白含量逐漸降低，這與孔治有等[1]在小麥種子老化研究中得出的結論一致，可能是由于細胞膜受到嚴重破壞導致可溶性蛋白的含量降低。

除了代謝活動、各種生理生化物質(zhì)含量變化之外，種子在老化過程中最明顯的特征是氧自由基(如O2-、H2O2等)數(shù)量的逐漸增多，以及核酸降解等生化反應。SOD、POD是細胞中重要的抗氧化酶，在防御細胞結構被活性氧損傷方面發(fā)揮著重要作用，酶活性的變化預示著種子內(nèi)部抗氧化系統(tǒng)抗氧化能力的變化?；钚匝?ROS)對細胞結構具有非常強的破壞能力，較低濃度的ROS可以誘導某些抗氧化酶基因表達，從而提高抗氧化酶活性，將適量的活性氧消除。試驗結果可以看出，在老化初期SOD、POD活性維持在較高水平，這與Jeng和 Sung等[26]的研究結果相類似，說明種子在貯藏初期會利用SOD、POD等抗氧化酶清除自由基，以保護細胞結構；但是隨著老化程度的加劇，SOD、POD等抗氧化酶活性逐漸降低，以致產(chǎn)生過剩自由基[25]。POD、SOD作為細胞的保護酶，在受到人工老化處理時，這些保護酶清除活性氧和自由基的能力減弱，從而影響細胞的正常代謝。此次試驗，在老化處理初期，保護酶的活性有明顯下降的趨勢，這會導致細胞內(nèi)活性氧和自由基的增加，隨著老化時間的延長，下降的趨勢慢慢平緩，說明老芒麥自身也具有一定的抗老化作用。

3.2 人工老化對老芒麥種子醇溶蛋白組成的影響

醇溶蛋白作為種子儲藏蛋白的一部分，在種子活力的維持方面發(fā)揮著重要作用。通過研究發(fā)現(xiàn)，與未老化的老芒麥種子醇溶蛋白圖譜相比，經(jīng)高溫高濕老化后種子條帶顏色開始變淺，有的條帶甚至消失。結果同譚富娟等[36]研究結果一致，通過對燕麥種子貯存后遺傳完整性研究發(fā)現(xiàn)，不同貯存年代種子的酯酶、淀粉酶、過氧化物酶等同工酶和醇溶蛋白圖譜，陳舊種子中條帶數(shù)明顯減少、顏色變淺。蛋白質(zhì)的種類以及含量變化是基因選擇性表達的結果，種子老化程度的加劇可能抑制了某些基因型的表達或者導致了某些存活能力較差的基因型消失，最終導致譜帶的丟失，這需要進一步從基因水平深入研究。

結合前人研究成果可以看出，種子老化是一個很復雜的生理生化代謝過程，活性氧(ROS)可能是加速種子老化的主要原因，試圖從抗氧化酶活性角度出發(fā)，尋找調(diào)控抗氧化酶表達的相關基因，提高其表達水平，在一定程度上可能延緩種子的老化進程，這也對稀有種質(zhì)以及瀕危植物物種種質(zhì)資源延續(xù)具有重要意義。

4 結論

(1)隨著人工老化處理程度的加重，電導率、丙二醛、可溶性糖含量逐漸上升；可溶性蛋白含量以及POD和SOD活性均降低，因此，該指標可作為種子生活力的衡量指標。

(2)種子在老化過程中醇溶蛋白發(fā)生了一系列的變化，醇溶蛋白圖譜顏色在處理第3 d時開始變淺，且隨著老化時間的延長，α，β和ω區(qū)醇溶蛋白出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象。