飼用玉米根腐病病原鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

陳應(yīng)娥，梁巧蘭，劉耀霞，王鑫偉，王興鐸，雷 雪，管亮亮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

飼用玉米是一種優(yōu)良的飼料作物，是重要的青貯飼料，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展具有決定性的重要作用[1-2]。其鮮草葉片柔軟、莖稈挺立、糖分含量高、生物產(chǎn)量高、適口性好、消化率高、飼用價(jià)值高，適于青貯或青貯飼用，適應(yīng)種植范圍廣[3]。草產(chǎn)量可以達(dá)到1.5×105kg/hm2，發(fā)展飼用玉米生產(chǎn)，既可以調(diào)整種植業(yè)結(jié)構(gòu)，避免種植結(jié)構(gòu)單一，也可為當(dāng)?shù)氐娘暳霞庸て髽I(yè)提供原材料，為養(yǎng)殖企業(yè)提供優(yōu)良的鮮草與青貯飼料，提高農(nóng)民的收益，促進(jìn)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展[4]。隨著甘肅省草牧業(yè)的發(fā)展和人民生活水平的提高，飼用玉米日益受到人們的重視，種植面積逐漸增加，但是連作造成玉米根腐病 (maize root rot)發(fā)生嚴(yán)重，病害發(fā)生后植株莖葉暗綠，病葉自葉尖向下或從邊緣逐漸變黃干枯，須根初期表現(xiàn)為水漬、變黃，后腐爛壞死，造成幼苗枯死，嚴(yán)重影響玉米生產(chǎn)[5]。有關(guān)甘肅省飼用玉米根腐病研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，試驗(yàn)對(duì)引起甘肅省飼用玉米根腐病的病原菌及其生物學(xué)特性和有效防治藥劑進(jìn)行了研究和篩選，以期對(duì)玉米根腐病的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

玉米根腐病病樣采自甘肅省古浪縣發(fā)病的玉米田；供試培養(yǎng)基選用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g)、玉米培養(yǎng)基(玉米300 g,瓊脂16 g)、PSA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂17 g)、胡蘿卜培養(yǎng)基(胡蘿卜200 g，糖20 g，瓊脂15 g)[6]；試驗(yàn)儀器為超凈工作臺(tái)、滅菌鍋、顯微照相機(jī)、顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平等；供試藥劑(表1)。

表1 供試藥劑及推薦使用濃度

注：供試藥劑8%惡霉靈為水劑，其他供試藥劑都為可濕性粉劑，下同

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離純化 在無(wú)菌條件下用剪刀在病健交界處剪1 mm×1 mm的方塊，置于按表1配方制備滅菌的PDA培養(yǎng)基平板上，在25℃的恒溫條件下培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)出的菌落直徑生長(zhǎng)至1 cm時(shí)，用接種針挑取菌落邊緣的菌絲置入另一皿PDA培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化后采用單孢分離法對(duì)分離菌進(jìn)一步純化，純化后分離物移入試管斜面培養(yǎng)基中，待長(zhǎng)出菌絲后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆肹7-9]，并觀察記錄分離菌的培養(yǎng)形態(tài)。

1.2.2 分離物致病性測(cè)定 用打孔器打取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d菌餅，接種到健康的玉米幼苗莖基部，以昆蟲(chóng)針刺傷玉米幼苗莖基部作“有傷接種”、以不刺傷作“無(wú)傷接種”，以接同樣大小的PDA菌餅作對(duì)照，每處理3株幼苗，重復(fù)3次。置于相同條件下培養(yǎng)，逐日觀察發(fā)病情況，判斷被接菌種致病能力的大小，并從接種后發(fā)病的玉米苗上進(jìn)行病原菌分離，進(jìn)一步確定分離物是否為致病菌。

1.2.3 病原菌鑒定 將致病性測(cè)定中分離出的致病性明顯病原菌在顯微鏡下觀察并記錄其菌落特征，菌絲、孢子形態(tài)等。依據(jù)文獻(xiàn)[10-11]的方法鑒定病原物類型，并將病原物形態(tài)特征進(jìn)行顯微照相。

1.3 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病原物的生長(zhǎng) 從發(fā)病程度嚴(yán)重的玉米苗上分離出的病原菌置于25℃條件下培養(yǎng)4 d，再用d=5 mm的打孔器打取菌餅，分別接入按照上述配方配置并經(jīng)高壓滅菌的PDA培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基中央，每處理3次重復(fù)。25℃條件下置于恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 d后觀察原物菌絲生長(zhǎng)的狀態(tài)及形態(tài)顏色，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑[12-13]，比較幾種培養(yǎng)基對(duì)病原物菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.3.2 不同溫度對(duì)病原物的生長(zhǎng) 用打孔器于培養(yǎng)4 d的菌落邊緣打取5 mm菌餅接種到滅菌的PDA平板上分別置于10、15、20、25、30、35℃條件下培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。4 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，比較不同溫度對(duì)病原物菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.3.3 不同光照條件對(duì)病原物的生長(zhǎng) 用打孔器取5 mm的菌餅接種到滅菌PDA平板上，分別放置于12 h光暗交替、24 h光照和24 h黑暗3種光照處理下，重復(fù)3次，4 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4 病原菌室內(nèi)藥劑篩選及毒力測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法[14]對(duì)主要致病菌進(jìn)行室內(nèi)藥劑篩選。用無(wú)菌水將各藥劑按表1中的濃度擴(kuò)大50倍配制成藥液，然后將藥液按對(duì)半稀釋法稀釋成5個(gè)濃度，將配好的藥劑吸取1 mL加入到49 mL滅菌冷卻到45℃的PDA中，將其倒入滅菌后的4個(gè)培養(yǎng)皿上，制成含藥培養(yǎng)基，并做好標(biāo)記。將培養(yǎng)4 d后的病原菌用打孔器打取5 mm的菌餅，將菌餅接到含藥PDA上，置于25℃的條件下培養(yǎng)，以加1 mL滅菌水的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)4次，96 h后十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。

抑菌率(%)=

根據(jù)藥劑濃度對(duì)數(shù)(橫坐標(biāo))及對(duì)應(yīng)的菌絲生長(zhǎng)抑制率概率值(縱坐標(biāo))作回歸分析，求出毒力回歸方程y=a+bx，并計(jì)算出藥劑抑制濃度(EC50)和相關(guān)系數(shù)，根據(jù)EC50評(píng)價(jià)殺菌劑毒力大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離鑒定

2.1.1 田間癥狀觀察 調(diào)查發(fā)現(xiàn)，感病玉米葉片卷曲發(fā)黃，毛根減少，根尖變鈍，植株萎蔫(圖1)。

2.1.2 病原菌分離純化 從玉米根腐病根部分離得到的真菌在PDA上的培養(yǎng)形態(tài)為菌絲稀疏突起羊毛狀。菌落粉白色至肉色，由于大量孢子生成而呈粉質(zhì)。大型分生孢子香腸形，頂細(xì)胞短、鈍圓，少許有彎曲，通常3～4個(gè)隔膜或不清，大小為26.44～39.61 μm×4.17～5.92 μm ；小型分生孢子數(shù)量多,橢圓形和卵形，無(wú)分隔，大小為5.54～8.12 μm×2.32～3.87 μm(圖2)。

2.1.3 分離物致病性測(cè)定及鑒定 將分離菌通過(guò)有傷和無(wú)傷接種到玉米莖基部后，發(fā)現(xiàn)玉米苗均有所感病，6 d時(shí)葉部逐漸變軟、萎蔫、黃化，根系逐漸變褐，變軟。15 d時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)有傷接種的苗子植株矮小甚至直接枯死，根部有腐爛，發(fā)病程度明顯比無(wú)傷接種嚴(yán)重。同時(shí)從發(fā)病玉米莖基部均能分離到與接種菌在PDA上培養(yǎng)形態(tài)一致的病原菌。經(jīng)培養(yǎng)形態(tài)觀察和致病性測(cè)定，結(jié)合真菌鑒定手冊(cè)將分離物鑒定為茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)。

圖1 玉米根腐病田間癥狀Fig.1 Symptoms of maize root rot disease in field

圖2 分離物培養(yǎng)形態(tài)及孢子形態(tài)Fig.2 Morphology and spore morphology of isolated fungi

2.2 茄病鐮刀菌生物學(xué)特性研究

2.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)茄病鐮刀菌生長(zhǎng)的影響 通過(guò)不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌的生長(zhǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明茄病鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，其菌落平均直徑達(dá)到80.67 mm，其次是PSA培養(yǎng)基，測(cè)得菌落平均直徑75.83 mm。4種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落直徑之間差異極顯著(P<0.01)(圖3)。

圖3 不同培養(yǎng)基處理下茄病鐮刀菌的生長(zhǎng)Fig.3 Effect of different media on the growth of Fusarium solani注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同

2.2.2 不同溫度對(duì)茄病鐮刀菌生長(zhǎng)的影響 茄病鐮刀菌在10～35℃均能生長(zhǎng)，較適生長(zhǎng)為25～30℃。其中，30℃條件下菌絲生長(zhǎng)狀況最好，菌落直徑達(dá)到84 mm，25℃菌落直徑為81 mm，15～30℃溫度條件下菌落直徑間差異極顯著(P<0.01)，10℃和30℃下菌落直徑間差異不顯著(圖4)。

圖4 溫度處理下茄病鐮刀菌的生長(zhǎng)Fig.4 Effect of temperature on the growth of Fusarium solani

2.2.3 不同光周期條件對(duì)茄病鐮刀菌生長(zhǎng)的影響 不同光周期條件對(duì)茄病鐮刀菌的生長(zhǎng)試驗(yàn)表明，光照對(duì)茄病鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響不大，培養(yǎng)4 d后菌落直徑在12 h光暗交替條件下最大，為76.00 mm，24 h黑暗條件下菌落直徑最小，為73.02 mm ，24 h全光照條件下的菌落直徑介于二者之間，為74.00 mm，不同光照條件下12 h光暗交替和其他兩個(gè)光照條件處理的菌落直徑之間差異極顯著(P<0.01)(圖5)。

圖5 光照處理下茄病鐮刀菌的生長(zhǎng)Fig.5 Effect of light on the growth of Fusarium solani

2.3 6種殺菌劑對(duì)茄病鐮刀菌抑菌作用及毒力測(cè)定

6種藥劑對(duì)茄病鐮刀菌的抑制作用測(cè)定表明，8%惡霉靈對(duì)茄病鐮刀菌的抑制效果最好，抑菌率為92.68%，其次抑菌效果較好的是80%多菌靈和75%百菌清，抑菌率分別為88.57%和85.33%，最差的是70%代森錳鋅，其抑菌率僅為49.43%，6種殺菌劑對(duì)茄病鐮刀菌的抑制率之間差異極顯著 (表2)。毒力測(cè)定結(jié)果表明，8%惡霉靈毒力最大，EC50值為28.50 μg/mL，50%福美雙劑毒力最小，EC50值為320.50 μg/mL，其他4種藥劑的毒力介于二者之間(表3)。

3 討論

20世紀(jì)90年代中期，玉米苗期病害在各玉米產(chǎn)區(qū)逐漸由次要病害上升為主要病害，重病地塊病株率高達(dá)100%，嚴(yán)重時(shí)全田死苗，造成毀種，成為玉米生產(chǎn)上的新障礙。玉米苗期根腐病是玉米苗期的重要病害之一，可造成田間大量死苗，重病地塊發(fā)病率達(dá)80%，且有逐年加重趨勢(shì)，給玉米生產(chǎn)造成嚴(yán)重危脅[15-16]。國(guó)外報(bào)道引起玉米根腐病的病原菌有禾生腐霉菌(Pythiumgraminicola)、禾谷鐮刀菌(fusariumgraminearum)、蠕孢菌 (Bipolarissorokinianum)，主要病原菌為腐霉菌(Pythiumgraminicola)和鐮刀菌(Fusariumgraminearum)，國(guó)內(nèi)報(bào)道的病原菌串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、串珠鐮刀菌膠孢變種(fusariummoniliformevar.subglutinans)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、蠕孢菌 (Bipolarissorokinianum)、腐霉菌(Pythiumgraminicola)、絲核菌(Rhizoctonia)等[17-18]。玉米莖腐病、穗腐病和苗期根腐病是危害玉米的3種重要病害，過(guò)去一直進(jìn)行單獨(dú)研究。玉米苗期根腐病的研究相對(duì)較少，是由多種病原菌復(fù)合侵染引起?？傊捎诘乩砑皻夂驐l件的差異，各地區(qū)對(duì)于引起玉米根腐病的病原菌的說(shuō)法各不一樣，在我國(guó)南方比較潮濕的地區(qū)報(bào)道較多的是腐霉菌(Pythium)，而在北方較干旱地區(qū)多為鐮刀菌(Fusarium)[19-20]。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)甘肅省種植的飼用玉米根腐研究發(fā)現(xiàn)病原菌為茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)。生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)茄病鐮刀菌的最適培養(yǎng)基為PDA，最適生長(zhǎng)溫度為30℃，光暗交替有利于該菌的生長(zhǎng)；8%惡霉靈水劑、80%多菌靈可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑對(duì)茄病鐮刀菌有較好的抑制效果，抑菌率分別為92.68%，88.57%和85.33%。EC50分別為28.50，45.50和97.50 μg/mL，可用于田間防治；有研究表明利用以化學(xué)農(nóng)藥為主要成分的武將450FS懸浮種衣劑、種子包衣劑處理種子可有效防治苗期根腐病[18,20-21]，木霉菌顆粒劑和種衣劑通過(guò)土壤穴施和種子包衣可有效防治玉米莖腐病和紋枯病，其中木霉菌顆粒劑防效達(dá)65%、87%[21]。而試驗(yàn)針對(duì)甘肅省飼用玉米根腐病病原菌僅分離得到一種強(qiáng)致病菌，對(duì)于是否存在其他病原菌、篩選的幾種藥劑的田間防效及其他種子包衣劑、生物農(nóng)藥的抑菌作用及防治效果等問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。

表2 6種殺菌劑對(duì)玉米根腐病菌的抑菌作用

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P≤0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P≤0.01)

表3 6種殺菌劑對(duì)茄病鐮刀菌的毒力

4 結(jié)論

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)引起甘肅省古浪縣飼用玉米根腐病的病原菌為茄病鐮刀菌；該病原菌菌絲最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，12 h光照、12 h黑暗交替有利于該菌的生長(zhǎng)；6種殺菌劑對(duì)玉米根腐病均有抑菌效果，其中8%惡霉靈、80%多菌靈、75%百菌清抑制率均在85%，分別為92.68%，88.57%和85.33%。EC50分別為28.50，45.50和97.50 μg/mL；該試驗(yàn)結(jié)果對(duì)指導(dǎo)古浪縣飼用玉米根腐病有效防治具有重要意義。