野生和室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道菌群多樣性的比較

譚春桃，李 歡，曲家鵬

（1. 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；4. 青海省動(dòng)物生態(tài)基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008）

腸道微生物在宿主的消化吸收、能量代謝、免疫調(diào)節(jié)以及生理健康等方面均有重要的作用[1-4]，且易受食物的影響[5-8]。腸道微生物通過提高宿主對(duì)高纖維、低蛋白植物的消化吸收能力，增強(qiáng)食物利用率和對(duì)極端環(huán)境的耐受性，維持食物匱乏時(shí)動(dòng)物的正常生理活動(dòng)[9-11]。腸道微生物還可以激發(fā)動(dòng)物的細(xì)胞與體液免疫，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力，降低疾病發(fā)生概率，維持宿主的生理健康[12-15]。某些植物對(duì)食草動(dòng)物的取食具有一定的防御作用，會(huì)形成次生化合物，而動(dòng)物的腸道微生物有助于動(dòng)物降解次生化合物，獲取食物資源，提高動(dòng)物的存活率[16-17]。盡管有關(guān)腸道微生物在人、模式動(dòng)物和低海拔地區(qū)分布動(dòng)物的研究較多[18-20]，但有關(guān)高海拔地區(qū)動(dòng)物腸道微生物的研究甚少。高海拔地區(qū)分布的動(dòng)物面臨低溫、低氧的極端環(huán)境，其腸道微生物可能具有更加復(fù)雜的多樣性和功能[21-22]。

高原鼠兔(Ochotona curzoniae)是小型植食性哺乳動(dòng)物，廣泛分布于青藏高原海拔 3 200～5 300 m的高海拔地區(qū)[23]。夏季野生高原鼠兔的食物來源豐富，以攝食垂穗披堿草(Elymus nutans)、黃花棘豆(Oxytropis ochrocephala)和早熟禾(Poa annua)等植物為主[24-25]。而室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔的食物主要由粗蛋白、粗纖維、粗脂肪等組成，具高能量、高蛋白、低纖維等特點(diǎn)。除此之外，高原鼠兔是青藏高原的特有種和關(guān)鍵種，維持著青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[26-27]。

隨著第二代高通量測序技術(shù)的發(fā)展，已有研究表明食物成分對(duì)高原鼠兔腸道微生物的組成和多樣性有顯著影響，個(gè)體的食物成分越相似，其腸道微生物組成與多樣性越相似[28]。高原鼠兔腸道微生物的組成和多樣性與種群密度有關(guān)，種群密度越高，個(gè)體間腸道微生物的相似度越高[29]。高原鼠兔的腸道微生物與環(huán)境微生物組成差異顯著，表明腸道微生物受環(huán)境影響小，且具有宿主選擇專一性[30]。盡管有關(guān)高原鼠兔腸道微生物的研究已有一系列的進(jìn)展，然而對(duì)于夏季野生和室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道微生物的差異尚不清楚。

為了更好地控制試驗(yàn)變量，往往需要將野生動(dòng)物帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比較[31]，已有研究表明野生和室內(nèi)飼養(yǎng)狀態(tài)下動(dòng)物的腸道菌群有顯著差異[32-33]。本研究基于16S rRNA基因高通量測序技術(shù)，研究夏季野生和室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道微生物的差異，探討室內(nèi)飼養(yǎng)條件下高原鼠兔是否會(huì)保留野生鼠兔的腸道菌群，以及保留了多少比例的菌群，為以后是否能在室內(nèi)飼養(yǎng)條件下研究野生小哺乳動(dòng)物的腸道菌群提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品收集

2014年6月，在青海省果洛藏族自治州瑪沁縣 (100°21′ E，34°24′ N，3 846 m)采用繩套法捕捉6只健康成年高原鼠兔帶回實(shí)驗(yàn)室。將鼠兔置于鼠籠 (聚丙烯材質(zhì)，310 mm× 230 mm× 160 mm)中單籠飼養(yǎng)，提供足夠的兔顆粒維持飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)和純凈水。8月10-12日08:00-10:00，使用75%乙醇擦拭滅菌過的眼科鑷收集新鮮糞便樣品置入無菌管中，快速轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。8月14-16日08:00-10:00，在瑪沁縣相同的野外樣地，使用繩套法捕捉高原鼠兔，置于75%乙醇消毒后的鼠籠中，使用滅菌后的眼科鑷收集新鮮糞便樣品置入無菌管中，并迅速置于液氮罐中，隨后轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。本研究共收集了室內(nèi)鼠兔糞便樣本6份(雌性4份，雄性2份)，野外鼠兔糞便樣本6份(雌性1份，雄性5份)。

1.2 食物組成

2014年8月16日14:00-18:00在樣地隨機(jī)選擇 10 個(gè) 25 cm × 25 cm 的樣方，刈割植物的地上部分并區(qū)分高原鼠兔喜食的物種，混勻后稱量植物鮮重，然后帶回實(shí)驗(yàn)室在75 ℃的恒溫箱中烘干至恒重并稱量計(jì)算植物中的水分含量，然后測定干物質(zhì)的營養(yǎng)成分，無氮浸出物成分復(fù)雜，主要成分有淀粉、單糖、有機(jī)酸和糊精等。無氮浸出物的含量等于干物質(zhì)含量減去粗蛋白、粗脂肪、粗纖維和粗灰分的含量。野外高原鼠兔喜食植物及營養(yǎng)成分和室內(nèi)飼料原料及營養(yǎng)成分如表1所列。

表1 野生和室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔食物原料及營養(yǎng)成分Table 1 Food material and nutrition contents of wild and laboratory-reared plateau pikas

1.3 16S rRNA 測序和生物信息學(xué)分析

采用生工Ezup柱式土壤DNA抽提試劑盒提取腸道內(nèi)容物的總DNA。用可見分光光度計(jì)對(duì)DNA 進(jìn)行集中純化。提取的 DNA 用 10 ng·μL-1的稀釋液用來做PCR擴(kuò)增。用通用引物515F(5-GTGY CAGCMGCCGCGGTA-3)，909R(5-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3)和 12 nt獨(dú)特的條形碼在 515F的5′末端擴(kuò)增微生物的 16S rRNA 的 V4-V5 區(qū)域[34]。PCR 擴(kuò)增用含有 1 × PCR 緩沖液的 25 μL 反應(yīng)混合物、1.5 mmol·L-1MgCl2和 0.2 mmol·L-1的脫氧核苷三磷酸加 1.0 μmol·L-1的引物和 0.25 U 的 Ex Taq，最后加入10 ng基因組DNA。為了減少PCR偏倚，每個(gè)樣品做2個(gè)PCR平行。在PCR儀上于94～96 ℃預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。先于94 ℃中保持3 min使模板變性，然后依次保持 94 ℃ 的 40 s、56 ℃ 的 60 s、72 ℃ 的 60 s，如此做 30 個(gè)循環(huán)，最后在 72 ℃ 中保留10 min使產(chǎn)物延伸完整。最后將純化的PCR產(chǎn)物匯集在相同濃度使用Illumina Miseq測序儀進(jìn)行測序[35]。

原始序列數(shù)據(jù)使用QIIME1.7.0處理(http://qiime.org/tutorials/tutorial.html)。所有序列都被修剪并根據(jù)條形碼分離每個(gè)樣本(條形碼錯(cuò)誤堿基 = 0)。使用Flash-1.2.8軟件根據(jù)雙末端序列重疊的區(qū)域進(jìn)行拼接[36]。獲得的雙末端序列進(jìn)行過濾(保留那些讀取長度 ＞ 300 bp，無模糊序列 N，平均序列質(zhì)量分?jǐn)?shù) ＞ 30的序列)作進(jìn)一步分析。由于在PCR擴(kuò)增葉綠體序列可能污染，采用Metaxa2軟件工具從大量的測序數(shù)據(jù)刪除葉綠體序列[37]。對(duì)齊的16S rRNA基因序列被用于使用Uchime算法進(jìn)行嵌合體檢查[38]。所有的序列使用CD-HIT以97%的相似度聚類為操作分類單元(OTU)，過濾只有1條序列的OTU[39]。為了比較不同測序深度的樣本，每個(gè)樣本的序列統(tǒng)一為5 070個(gè)序列。計(jì)算α多樣性指數(shù)，包括PD_whole_tree，Chao1，Shannon，Observed-species，Goodscoverage，Simpson，Equitability等多樣性指數(shù)，通過 QIIME處理計(jì)算 weighted UniFrac和 unweighted UniFrac 距離矩陣[40]。

原始序列數(shù)據(jù)可在歐洲核苷酸數(shù)據(jù)庫中獲得，數(shù)據(jù)編號(hào)及網(wǎng)址為PRJEB26642 (http://www.ebi.ac.uk/ena/datd/view/PRJEB26642)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

前期研究已表明，性別對(duì)高原鼠兔腸道微生物無顯著影響[28-29]，故本研究沒有分析性別對(duì)高原鼠兔腸道微生物的影響。采用單因素方差分析，比較室內(nèi)與野生高原鼠兔腸道微生物的α多樣性與組成的差異?；贠TUs使用Venny 2.1.0做維恩圖，分析兩組鼠兔腸道微生物的差異大小。使用vegan package對(duì) weighted UniFrac和 unweighted UniFra距離矩陣分別進(jìn)行PCoA分析來比較兩組鼠兔腸道微生物群落結(jié)構(gòu)(β多樣性)的差異。除維恩圖外，其余統(tǒng)計(jì)分析均在R 3.2.5上實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 腸道微生物組成

在門的水平上，野生高原鼠兔腸道微生物主要由擬桿菌門 (Bacteroidetes)(43.06% ± 5.52%)、變形菌門 (Proteobacteria)(24.84% ± 5.70%)、厚壁菌門 (Firmic utes)(11.21% ± 4.07%)、 放 線 菌 門 (Actinobacteria)(8.62% ± 3.14%)、 藍(lán) 細(xì) 菌 (Cyanobacteria)(0.98% ±0.11%)和 螺 旋 體 門 (Spirochaetes)(0.75% ± 0.31%)、疣 微 菌 門 (Verrucomicrobia)(0.31% ± 0.20%)等 組成；室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道微生物主要由擬桿菌門 (61.61% ± 5.57%)、 厚 壁 菌 門 (21.82% ± 3.15%)、變形菌門 (4.32% ± 1.31%)、疣微菌門(2.41% ± 1.38%)、螺旋體門 (2.11% ± 0.50%)、藍(lán)細(xì)菌 (1.23% ± 0.16%)和放線菌門 (0.68% ± 0.07%)等組成 (圖 1)。

在門的水平上，室內(nèi)鼠兔腸道微生物中擬桿菌門和螺旋體菌門的相對(duì)豐度顯著高于野生鼠兔，而變形菌門和放線菌門的相對(duì)豐度顯著低于野生鼠兔(表2)。在屬的水平上，室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道微生物中S24-7中某屬、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、擬桿菌科下某屬、梭菌屬(Clostridium)、梭菌目下某屬、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、瘤胃菌科下某屬、肉桿菌屬(Carnobacterium)的豐度均顯著高于野生鼠兔，而黃桿菌屬(Flavobacterium)、叢毛單胞菌科下某屬(Comamonadaceae.Other)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、毛螺旋菌科下某屬(Lachnospiraceae.Other)的豐度均顯著低于野生鼠兔(P＜0.05)(表 2)?；?OTUs表的維恩圖分析，結(jié)果表明野生和室內(nèi)飼養(yǎng)鼠兔的OTUs有50.1%重疊，而49.9%的OTUs是各自特有的(圖2)。

圖1 野生和室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道菌群在門水平上的組成成分(僅顯示相對(duì)含量 ＞ 1%的菌群)Figure 1 Composition of bacterial communities at phylum level in the gut microbial communities between wild and laboratory-reared plateau pikas (Only those phyla with mean relative abundance ＞ 1% were shown)

2.2 腸道微生物的多樣性

野外和室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道微生物的α多樣性指數(shù)均無顯著差異 (P ＞ 0.05)(表 3)。為了評(píng)估β多樣性，分別計(jì)算了weighted UniFrac距離矩陣和unweighted UniFrac距離矩陣，前者能更清楚地展示野生和室內(nèi)飼養(yǎng)鼠兔腸道微生物的差異，使用weighted UniFrac距離矩陣做PCoA主坐標(biāo)分析能將野生和室內(nèi)飼養(yǎng)的高原鼠兔腸道微生物明顯分開(圖3)，其β多樣性具有顯著差異。

3 討論與結(jié)論

夏季野生和室內(nèi)飼養(yǎng)的高原鼠兔腸道微生物在組成成分上有顯著差異。在門的水平上，野生高原鼠兔腸道微生物主要由擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門組成，而室內(nèi)飼養(yǎng)鼠兔腸道微生物主要由擬桿菌門和厚壁菌門組成。室內(nèi)飼養(yǎng)鼠兔腸道微生物中擬桿菌門和螺旋體菌門顯著高于野生鼠兔，其中擬桿菌門中的S24-7的豐度高于野生鼠兔。S24-7易受環(huán)境和食物的影響，Ormerod等[41]發(fā)現(xiàn)S24-7中有多種細(xì)菌會(huì)使降解碳水化合物的酶豐度增加，本研究中室內(nèi)飼養(yǎng)食物無氮浸出物的含量顯著高于野生食物，S24-7能提高動(dòng)物腸道對(duì)無氮浸出物中淀粉等碳水化合物的利用，這可能是導(dǎo)致室內(nèi)飼養(yǎng)鼠兔腸道中S24-7的豐度顯著高于野生個(gè)體的主要原因。放線菌門中大多數(shù)細(xì)菌可以降解纖維素[42]，野生高原鼠兔腸道微生物中放線菌門豐度顯著高于室內(nèi)鼠兔，可能與野外食物資源中纖維成分高于室內(nèi)飼料有關(guān)。野生鼠兔腸道菌群中黃桿菌屬、金黃桿菌屬、假單胞菌屬、從毛單胞菌科下某屬和毛螺旋菌科下某屬的豐度均顯著高于室內(nèi)飼養(yǎng)鼠兔。擬桿菌門中的黃桿菌屬和金黃桿菌屬、變形菌門中的假單胞菌屬都是動(dòng)物最常見的致病菌[43-45]，這可能是導(dǎo)致夏季野生鼠兔高死亡率的原因之一[46-47]。

表2 野生和室內(nèi)飼養(yǎng)鼠兔腸道微生物在主要門和屬(平均相對(duì)含量 ＞ 1%)水平上比較(平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤)Table 2 Comparison of main phyla and genera (mean relative abundance ＞ 1%) of gut microbial communities in wild and laboratory-reared plateau pikas (Mean ± SE)

圖2 維恩圖顯示野生和室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道菌群OTUs的重疊Figure 2 Venn diagram showing the overlapped OTUs of gut microbial communities between wild and laboratory-reared plateau pikas

維恩圖結(jié)果表明，室內(nèi)飼養(yǎng)和野生高原鼠兔腸道微生物的OTUs有49.9%是各自特有的，這可能是由于室內(nèi)飼養(yǎng)與野生自然條件下，動(dòng)物食物和環(huán)境的差異造成的。例如，對(duì)火雞的研究發(fā)現(xiàn)，食物是引起馴養(yǎng)和野生火雞腸道微生物差異的主要原因之一[48]。對(duì)圈養(yǎng)和野生斑海豹腸道菌群的研究亦表明，食物和環(huán)境是造成二者腸道微生物差異的主要原因，且圈養(yǎng)斑海豹腸道微生物的OTUs豐度增加[49]，與本研究結(jié)果一致。

夏季野生和室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道微生物的α多樣性均無顯著差異，這可能有以下幾個(gè)原因。首先，宿主具有選擇專一性。動(dòng)物會(huì)選擇環(huán)境中有利的細(xì)菌，來維持腸道微生物α多樣性的穩(wěn)定。高原鼠兔的腸道微生物并沒有選擇環(huán)境中豐度較高的細(xì)菌，而是選擇環(huán)境中罕見、對(duì)宿主有益的細(xì)菌[30]。其次，微生物間的競爭。新環(huán)境中的微生物與腸道中已有微生物形成競爭關(guān)系，但新環(huán)境中的微生物很難排擠掉已有的微生物來獲取生態(tài)位和資源，從而維持α多樣性的穩(wěn)定，導(dǎo)致兩組腸道微生物的α多樣性沒有顯著差異[50]。最后，某些環(huán)境罕見細(xì)菌不能吸附于腸道內(nèi)，也無法在腸道內(nèi)繁殖。盡管野外與室內(nèi)的環(huán)境和食物條件差異明顯，但野生鼠兔轉(zhuǎn)移到室內(nèi)后，新的微生物無法在室內(nèi)鼠兔腸道內(nèi)定居、繁殖。例如，在草魚食物中加入枯草芽孢桿菌后，在其腸道中并沒有檢測到枯草芽孢桿菌[15]。

表3 野生和室內(nèi)飼養(yǎng)鼠兔腸道菌群的α多樣性比較Table 3 Comparison of alpha diversity of gut microbial communities between wild and laboratory-reared plateau pikas

圖3 野生和室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道微生物基于加權(quán)UniFrac矩陣距離的主坐標(biāo)分析Figure 3 Principal coordinate analysis (PCoA) of the weighted UniFrac dissimilarity metrics compared with the gut microbial communities between wild and laboratory-reared plateau pikas

夏季野生和室內(nèi)飼養(yǎng)高原鼠兔腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)(β多樣性)具有顯著性差異，可能有兩種原因。一方面，野生和室內(nèi)飼養(yǎng)鼠兔的食物不同，食物的差異會(huì)導(dǎo)致腸道微生物群落結(jié)構(gòu)變化[51]；另一方面，野生和室內(nèi)飼養(yǎng)鼠兔生活環(huán)境的不同，環(huán)境微生物的不同也可能會(huì)影響腸道微生物群落結(jié)構(gòu)[52]。

本研究首次比較了夏季野生和室內(nèi)飼養(yǎng)條件下高原鼠兔腸道微生物，發(fā)現(xiàn)二者在微生物組成成分和群落結(jié)構(gòu)上均有顯著性差異，室內(nèi)飼養(yǎng)顯著改變高原鼠兔的腸道微生物，因此，室內(nèi)飼養(yǎng)不能有效反映野生狀態(tài)下高原鼠兔腸道菌群的情況。在今后開展野生動(dòng)物腸道菌群研究中，需要考慮野生和實(shí)驗(yàn)室條件下二者的差異。