利用近紅外光譜技術快速評定油菜秸稈的營養(yǎng)價值

閆佰鵬，王芳彬，李成海，周文靜，李發(fā)弟,4，李 飛

（1. 蘭州大學草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 / 蘭州大學農業(yè)農村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 / 蘭州大學草地農業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020；2. 甘肅省畜牧業(yè)產業(yè)管理局，甘肅 蘭州 730070；3. 金昌居佳生態(tài)農業(yè)有限公司，甘肅 金昌 737100；4. 甘肅省肉羊繁育生物技術工程實驗室，甘肅 民勤 733300）

秸稈資源的合理、高效利用對國民生產意義重大，其具有可再生、分布廣、數量多、低污染等特點，已成為可持續(xù)發(fā)展的支柱能源之一[1]。據報道，全球14%的能源是由農作物秸稈產生[2]，同時秸稈也是反芻動物主要的粗飼料來源，并為反芻動物瘤胃微生物和自身供能[3]。我國秸稈資源豐富，油菜秸稈占秸稈總量的4.2%[4]，其粗蛋白(crude protein, CP)含量優(yōu)于同地區(qū)種植玉米(Zea mays)秸稈、小麥(Triticum aestivum)秸稈與大豆(Glycine max)秸稈[5]。劉建勝[6]研究表明，與常規(guī)作物秸稈相比，油菜秸稈用作反芻動物飼料的比例僅為13.0%，約40%的油菜秸稈被用作燃料，造成了油菜秸稈的嚴重浪費。張勇等[7]用油菜秸稈型顆粒飼糧飼喂6月齡湖羊，結果表明，油菜秸稈型顆粒飼糧對湖羊健康無不良影響，同時可降低飼料成本，增加養(yǎng)殖效益；張吉鹍等[8]利用飼料分級指數 (GI)方法對花生 (Arachis hypogaea)藤、紅薯(Dioscorea esculenta)藤與油菜秸稈等粗飼料進行評定，研究發(fā)現油菜秸稈 (GI = 0.30)低于花生藤 (GI =1.48)與紅薯藤 (GI = 1.65)，但高于測定的玉米秸稈(GI = 0.20)和谷草 (GI = 0.17)，表明油菜秸稈是一種具有開發(fā)潛力的粗飼料，可作為反芻動物粗飼料來源。因此，評價油菜秸稈營養(yǎng)價值對反芻動物精準飼養(yǎng)、合理利用資源、優(yōu)化飼糧配方具有生產實踐意義。

NIRS (near-infrared reflectance spectroscopy)技術是20世紀70年代新興發(fā)展的一種快速、精確、非破壞性分析技術，已被廣泛應用于飼料原料營養(yǎng)成分分析[9]。飼料原料成分對近紅外光譜具有不同吸收程度進而得到不同的近紅外光譜。近紅外光譜技術通過主成分分析 (priciple component analysis,PCA)、偏最小二乘法 (partial least square, PLS)、人工神經網絡 (artificial neural network, ANN)等現代分析手段，建立物質光譜與待測成分含量間的線性或非線性模型，從而實現用物質近紅外光譜信息對待測成分含量的快速計算[10]。目前，國內NIRS技術在粗飼料方面應用范圍非常廣泛，但主要集中在玉米秸稈、水稻(Oryza sativa)秸稈、小麥秸稈等常規(guī)粗飼料資源。油菜是我國的主要油料作物之一，在我國長江流域、東北地區(qū)和西北地區(qū)廣泛種植，秸稈年產量達到4千萬t[11]，秸稈資源豐富。但對于油菜秸稈資源利用效率低下、利用方式單一與基礎研究較少是限制油菜秸稈利用的主要限制因素。因此，本研究旨在利用NIRS對油菜秸稈的營養(yǎng)成分建立定標模型，通過內部交叉驗證與外部驗證，預測NIRS技術對油菜秸稈營養(yǎng)價值評定的可行性，為生產實踐快速評定油菜秸稈的營養(yǎng)價值提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與制備

本研究共采集油菜秸稈樣品125份，油菜秸稈樣品分布信息與采樣份數如表1所列。選取具有代表性、無霉變、質量為1.5～2.0 kg的整株脫籽油菜秸稈樣品。將采集到的整株油菜秸稈樣品鍘至3～5 cm段，利用粉碎機(中型粉碎機F220)進行粉碎，過0.425 mm飼料分析篩后將樣品混合均勻，裝入自封袋密封保存、備用。

表1 油菜秸稈樣品分布信息與采樣份數Table 1 Distribution information and sample number of rape straw samples

1.2 油菜秸稈NIRS預測模型的建立

1.2.1 近紅外光譜圖的采集

試驗采用NIRS 5000(丹麥，FOSS)近紅外光譜分析儀對油菜秸稈進行近紅外光譜的采集，利用配套的WinISI Ⅲ軟件進行近紅外預測模型的建立與驗證。采集光譜時每個樣品重復掃描3次，最后取平均值得到平均光譜圖譜。

1.2.2 模型建立與驗證

使用近紅外光譜分析儀配套的WinISI Ⅲ軟件進行儀器操作及光譜數據和參比數據分析，并對各個養(yǎng)分進行定標模型構建。樣品按照4∶1的比例，隨機分成定標集 (N = 100)和驗證集 (N = 25)，分別用于定標模型的建立和外部驗證。本研究在進行回歸技術選擇時，選擇改進最小二乘法回歸技術進行油菜秸稈近紅外模型的建立。在定標過程中，為了消除無關信息與噪聲對試驗的干擾，利用7種去散射處理和3種導數處理對原始光譜進行預處理。模型建立過程中，根據軟件建議值分別設置相應窗口，交叉驗證 (cross validation groups)分組數目窗口建議值為5，超常樣品刪除批次 (number of outlier elimination passes)窗口建議值為 2，缺省數 (missing date value)據默認窗口建議值為 0，T 值超 常 樣 品 (critical T outlier)窗 口 ， 確 認 顯 示 值 為2.5，其表示當建立定標模型后利用此模型預測定標樣品集。若預測結果與傳統(tǒng)化學測定結果的差大于該定標誤差的2.5倍，則被認為是T值超常樣品。H 值超常樣品 (critical H outlier)窗口，確認顯示值為10，其定義為若樣品的GH值大于10(或某樣品的偏差大于定標樣品集平均偏差10倍)，則將被認為是光譜值超常樣品，進行剔除。

1.2.3 近紅外光譜評價參數

油菜秸稈定標模型建立時，以Modified PLS與不同光譜處理方法及參數進行搭配組合進行油菜秸稈近紅外模型的建立，并且通過內部與外部驗證來比較模型預測值與實際測定值之間的偏離程度。定標模型建立后，用交叉驗證相關系數(1 minus the variance ration, 1-VR)、 交 叉 驗 證 誤 差 (standard error of cross validation, SECV)和分析值與預測值的標準偏差 (standard error of calibration, SEC)3 個指標來作為定標模型優(yōu)劣選擇的指標。若預測模型的1-VR值越接近1，即為最佳模型；SECV可以大致評估定標模型預測的準確度，其值越小越有利于最佳模型的挑選。SEC表示分析值與預測值之間的標準偏差。對驗證集評價的指標主要有定標相關系數(R squared，RSQ)、Bias為測定值與預測值之間的平均偏差和SEP即驗證標準分析誤差3個指標。當RSQ值較大而Bias值較小時，即為最佳模型。

2 結果與分析

2.1 油菜秸稈樣品近紅外光譜圖

根據125份油菜秸稈樣品掃描所得近紅外原始光譜圖 (圖1)可知，油菜秸稈樣品在整個光譜范圍內各波長處具有不同的吸收特點，在1 450 cm-1和1 799 ～2 149 cm-1吸收強度明顯增強，有強烈的吸收峰。為了消除光譜掃描包含的背景信息、噪聲信息及基線漂移帶來的影響，提高光譜分辨率，清楚地表明光譜的變化，圖2與圖3分別為油菜秸稈樣品經一階導數處理和二階導數處理的原始光譜圖。

圖1 125份油菜秸稈樣品近紅外光譜圖Figure 1 The original near infrared spectrum of 125 rape straw samples

圖2 125份油菜秸稈樣品一階導數處理光譜圖Figure 2 First derivative of near infrared spectrum of 125 rape straw samples

圖3 125份油菜秸稈樣品二階導數處理光譜圖Figure 3 Second derivative of near infrared spectrum of 125 rape straw samples

2.2 油菜秸稈營養(yǎng)成分近紅外模型建立

2.2.1 油菜秸稈營養(yǎng)成分

油菜秸稈樣品中DM含量變化范圍為91.20%～96.39%，平均值為93.62%；CP含量變化范圍為2.06%～15.92%，平均值為5.85%；NDF含量變化范圍為50.51%～82.12%，平均值為67.22%；ADF含量變化范圍為41.44%～65.38%，平均值為55.40%；Ash含量變化范圍為4.12%～12.46%，平均值為7.66%；EE含量變化范圍為0.27%～9.84%，平均值為2.57%；NDIP含量變化范圍為0.50%～2.10%，平均值為1.04%；ADIP含量變化范圍為0.26%～1.70%，平均值為0.63%；ADL含量變化范圍為6.73%～22.33%，平均值為13.58%；NPN含量變化范圍為0.01%～6.04%，平均值為1.70%；SP含量變化范圍為0.46%～10.17%，平均值為2.89%(表2)。

2.2.2 不同處理方法油菜秸稈樣品近紅外模型選擇

油菜秸稈各營養(yǎng)成分指標的最優(yōu)組合分別為：DM 為Standard MSC 和 1，4，4，1；CP 為Weighted MSC 和 2，4，4，1；NDF 為 SNV 和 2，4，4，1；ADF為 Detrend和 2， 4， 4， 1； EE為 Inverse MSC 和 2， 4， 4， 1； Ash為 SNV and Detrend和1，4，4，1；NDIP 為 Weighted MSC 和 2，4，4，1； ADIP為 Detrend和 1， 4， 4， 1； ADL 為SNV 和 2，4，4，1；NPN 為 Weighted MSC 和 1，4，4，1；SP 為 Weighted MSC 和 1，4，4，1(表 3)。各營養(yǎng)成分指標所對應的SECV和1-VR值分別為：DM 為0.326 2 和0.912 0，CP 為0.325 2 和0.990 8，NDF 為 1.762 5 和 0.900 4，ADF 為 3.856 6 和 0.709 8，EE 為 0.352 5 和 0.974 2，Ash 為 0.471 3 和 0.913 5，NDIP 為0.239 6 和0.442 7，ADIP 為0.122 1 和0.675 9，ADL 為 1.498 6 和 0.458 2，NPN 為 0.377 5 和 0.924 6，SP 為 0.612 8 和 0.928 5。

表2 油菜秸稈營養(yǎng)成分Table 2 The nutrient content of rape straw

表3 油菜秸稈各營養(yǎng)成分指標最佳定標模型Table 3 Optimal NIRS prediction models for nutrition index of rape straw

2.3 油菜秸稈營養(yǎng)成分近紅外模型的驗證

2.3.1 驗證集油菜秸稈樣品營養(yǎng)成分

油菜秸稈驗證集所用樣品數為25份。用于外部驗證的油菜秸稈樣品各營養(yǎng)成分的含量，DM含量變化范圍為91.82%～95.92%，平均值為93.62%；CP含量變化范圍為2.26%～11.00%，平均值為5.54%；NDF含量變化范圍為54.55%～78.52%，平均值為70.47%；ADF含量變化范圍為39.76%～65.30%，平均值為56.00%；Ash含量變化范圍為4.91%～9.50%，平均值為7.28%；EE含量變化范圍為0.46%～6.06%，平均值為2.27%；NDIP含量變化范圍為0.67%～1.88%，平均值為1.02%；ADIP含量變化范圍為0.19%～1.29%，平均值為0.64%；ADL含量變化范圍為10.39%～18.92%，平均值為13.62%；NPN含量變化范圍為0.36%～4.59%，平均值為1.34%；SP含量變化范圍為0.64%～6.86%，平均值為2.53% (表4)。

2.3.2 油菜秸稈各營養(yǎng)成分最佳模型驗證結果

油菜秸稈 DM、CP、NDF、ADF、EE、Ash、NDIP、ADIP、ADL、NPN和SP成分的最佳定標模型內部驗證RSQ值分別為0.901、0.938、0.586、0.710、0.922、0.788、0.392、0.580、0.379、0.794、0.827， Bias值 分 別 為 -0.047、 -0.117、 -0.038、0.049、 -0.024、 -0.046、 0.029、 0.016、 0.081、-0.105、0.213；外部驗證 RSQ值分別為 0.865、0.970、0.112、0.477、0.707、0.471、0.145、0.367、0.353、0.645、0.673，Bias值分別為-0.093、-0.035、2.275、 -0.398、 -0.008、 -0.149、 0.030、 0.008、-0.153、-0.222、-0.104(表 5)。

表4 驗證集油菜秸稈營養(yǎng)成分含量Table 4 The result of nutrient content of rape straw in validation set

表5 最佳定標模型驗證結果Table 5 The result of best calibration model validation

3 討論

20世紀70年代Norris等[12]使用近紅外光譜技術測定了苜蓿(Medicago sativa)、高羊茅(Festca arundinacea)等飼草原料中CP、NDF與ADF等的含量，證實了近紅外光譜技術用于快速評定飼草質量的可行性。迄今，隨著近紅外光譜技術的不斷發(fā)展與完善，NIRS已被更加廣泛的應用于飼料常規(guī)營養(yǎng)成分、肉品質及乳品質分析的研究中[13-15]，進一步肯定了NIRS對飼料營養(yǎng)價值評定、畜產品安全評定的可行性，推動了畜牧業(yè)的快速發(fā)展。

NIRS技術的測定結果會受到樣品因素、參比值的準確性、儀器的穩(wěn)定性及操作環(huán)境等諸多因素的影響[16-17]，其中樣品因素尤為重要，因此采集樣品需具有代表性；史永剛等[18]研究指出待測樣品的代表性和濕化學分析結果會對近紅外分析結果準確性產生較大影響，本研究采用的采樣方法和營養(yǎng)成分測定方法為國家標準方法或公共認可方法，測定過程中進行多次重復，平行測定值之間的誤差均在所要求范圍內，其中CP、EE、SP、NPN測定結果的變異系數較大，高于50%，其余各指標測定結果變異系數均較小。

大量學者利用NIRS分析技術評定飼料營養(yǎng)價值且該技術已是測定飼料營養(yǎng)成分的方法之一。Yang等[19]利用NIRS技術對我國西南地區(qū)的燕麥(Avena sativa)進行了飼料化學品質的測定，測定項目主要包括CP、ADF、NDF與水溶性碳水化合物(WSC)，結果表明對于CP、NDF、ADF與WSC含量的最佳模型其波長位置為 4 247～6 102 cm-1、4 247～ 5 450 cm-1、 5 446～ 6 102 cm-1和 4 247～4 602 cm-1，且預測值與測定值具有較高的相關性(R2CV, CP = 0.99，NDF = 0.94，ADF = 0.92，WSC =0.88)，其指標模型可用于日常分析。Asekova[20]以不同品種的大豆(N = 353)為研究對象，對CP、CF、NDF和ADF利用NIRS技術構建模型，研究結果表明CP、CF最佳定標模型所對應的光譜處理和參數為 (2，5，5，1; MSC)，NDF 和 ADF 最佳定標模型所對應的光譜處理和參數為(1，4，4，1; MSC)，其構建模型可以用于大豆營養(yǎng)價值的預測；劉賢等[21]以158個不同種類的青貯秸稈飼料為研究對象，利用近紅外反射光譜技術建立了常規(guī)營養(yǎng)成分含量的定量校正分析模型，研究發(fā)現常規(guī)營養(yǎng)成分校正模型的R2≥ 0.86，可以用于快速測定秸稈青貯飼料的營養(yǎng)成分；白琪林等[22]與邰書靜等[23]均以玉米秸稈為試驗材料，構建玉米秸稈ADF、NDF含量的NIRS分析模型，其NDF和ADF近紅外校正模型校正系數均大于0.90；以上大量研究均表明，NIRS技術已廣泛用于飼料原料營養(yǎng)成分分析中，同時驗證了NIRS對飼料營養(yǎng)價值評定的可行性，本研究油菜秸稈定標模型的各營養(yǎng)成分指標所對應的1-VR值除NDIP、ADIP和ADL指標外，其余各指標1-VR均在0.9左右；內部驗證RSQ 值 分 別 為 DM 0.901，CP 0.938， NDF 0.586，ADF 0.710， EE 0.922， Ash 0.788， NDIP 0.392，ADIP 0.580，ADL 0.379，NPN 0.794，SP 0.827；外部驗證RSQ值分別為0.865、0.970、0.112、0.477、0.707、0.471、0.145、0.367、0.353、0.645、0.673，通過以上結果可以看出，內部驗證結果優(yōu)于外部驗證結果，這可能與飼料樣品的性質、實驗室測定值的誤差以及所選取的外部驗證樣本數有關，在后續(xù)研究中應當注意樣本數對外部驗證結果的影響[24]。在本研究中，油菜秸稈DM、CP、ADF、EE、Ash、NPN和SP等營養(yǎng)成分的校正模型是可用的，其余營養(yǎng)成分利用NIRS技術進行檢測的可行性需進一步研究。

4 結論

本研究利用近紅外光譜分析技術對油菜秸稈樣品的營養(yǎng)成分進行測定，建立了近紅外定標模型，同時篩選出各營養(yǎng)成分最優(yōu)組合，DM、CP、NDF、ADF、EE、Ash和 SP的 1-VR均在 0.9左右，所構建的NIRS模型可用于日常分析。然而，NDIP、ADIP和ADL所構建NIRS模型效果不太理想，需進一步優(yōu)化模型。NIRS可以作為可靠、快速的分析工具，取代耗時耗力的濕化學分析方法，是一種廉價、綠色安全的分析技術，在動物營養(yǎng)方面，能夠及時掌握、調整飼糧配方進而使得動物生產性能最大化。