能源植物柳枝稷基因工程研究進(jìn)展

曹慧穎，張立軍，阮燕曄，張 敖，董小妹，張馨悅

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 / 遼寧省植物基因工程技術(shù)研究中心, 遼寧 沈陽(yáng)110866）

改革開(kāi)放以來(lái)，中國(guó)經(jīng)濟(jì)持續(xù)高速發(fā)展，目前已經(jīng)成為僅次于美國(guó)的第二大經(jīng)濟(jì)體[1]。經(jīng)濟(jì)的發(fā)展伴隨著能源的巨大消耗，但我國(guó)的能源分布情況是富煤、貧油、少氣。從1997年開(kāi)始，中國(guó)成為能源的純進(jìn)口國(guó)，1998年石油進(jìn)口量為0.55億t，而 2015年石油進(jìn)口量升至3.36億t[2]，石油進(jìn)口量正以驚人的速度攀升。能源不足，是困擾中國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要問(wèn)題。除了進(jìn)口，科學(xué)家們正在努力從多個(gè)角度開(kāi)發(fā)新能源，比如風(fēng)能、太陽(yáng)能、核能、水能、地?zé)崮?。在生物領(lǐng)域，植物通過(guò)光合作用將大量能量?jī)?chǔ)存在其生物質(zhì)中，因此研究利用植物生物質(zhì)能源是一個(gè)重要課題。柳枝稷(Panicum virgatum)也因此受到更多研究者的關(guān)注。

柳枝稷屬于禾本科黍?qū)?，起源于北美。其根系發(fā)達(dá)，生產(chǎn)力高，水利用率高，同時(shí)環(huán)境適應(yīng)性好，在干旱、貧瘠甚至是鹽堿地都能生長(zhǎng)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，將柳枝稷的生物質(zhì)與煤炭混燃發(fā)電，是生物質(zhì)利用成本最為低廉的方式。將10%柳枝稷和90%煤炭混合具有較好的燃燒性能，SOx和NOx的排放量也相應(yīng)降低[5]。儲(chǔ)存在柳枝稷纖維素生物質(zhì)中的多糖可以通過(guò)微生物發(fā)酵、高溫分解或者氣化轉(zhuǎn)化為生物燃料，美國(guó)能源部已經(jīng)把柳枝稷作為專用的能源作物[6-8]，我國(guó)已經(jīng)引種并且正在推廣[9-10]。

由于柳枝稷木質(zhì)素含量高，同時(shí)進(jìn)一步提高抗逆性有利于其更好地服務(wù)于能源生產(chǎn)，因此有必要對(duì)柳枝稷進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪z傳育種改良[11]。但是柳枝稷具有自交不親和及異源多倍體等遺傳特性，應(yīng)用傳統(tǒng)育種方法難以改良[12]。基因工程技術(shù)是一種快速、有效的育種手段，可以克服傳統(tǒng)育種方法的不足。本文從基因型、遺傳轉(zhuǎn)化方法及功能基因改良等方面綜述能源作物柳枝稷的基因工程研究進(jìn)展，以期為培育更加優(yōu)良的柳枝稷品種、提供新能源材料奠定基礎(chǔ)。

1 柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化影響因素

1.1 轉(zhuǎn)化技術(shù)的影響

植物基因工程育種是一種快速、便捷的育種技術(shù)，可以克服傳統(tǒng)育種周期長(zhǎng)、不能實(shí)現(xiàn)超遠(yuǎn)緣雜交等缺點(diǎn)。但是要應(yīng)用該技術(shù)，首先要建立高效的柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化體系。目前柳枝稷的轉(zhuǎn)化主要采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌能將自身染色體外Tumor-inducing (Ti)質(zhì)粒的一段 DNA (T-DNA)轉(zhuǎn)移到宿主植物細(xì)胞中，如果有外源基因插入到T-DNA中，也可以隨著T-DNA的轉(zhuǎn)移一起整合進(jìn)入植物基因組[13]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)最早被應(yīng)用在雙子葉植物中，由于單子葉植物尤其是禾本科植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，所以該系統(tǒng)在單子葉植物中的應(yīng)用進(jìn)展緩慢。之后隨著人們對(duì)農(nóng)桿菌侵染機(jī)制了解的深入，轉(zhuǎn)化技術(shù)也有所改進(jìn)完善，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化首先在水稻(Oryza sativa)[14]和玉米(Zea mays)[15]中取得了突破性進(jìn)展。與其他轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比， 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有遺傳穩(wěn)定、拷貝數(shù)低、成本低和基因沉默現(xiàn)象少等優(yōu)點(diǎn)[16-17]。

為了提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化效率，在實(shí)際工作中，研究人員開(kāi)發(fā)出一些輔助措施，以增加外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的幾率。如使用超聲波[18-19]、真空滲透[19]、熱激、離心[20]、表面活性劑[21]、碳化硅纖維[22]處理外植體，以及共培養(yǎng)時(shí)使用半胱氨酸等巰基化合物[23-24]等。這些輔助技術(shù)也被應(yīng)用在柳枝稷轉(zhuǎn)化中。

Li等[25]在柳枝稷的轉(zhuǎn)化中，首先由種子誘導(dǎo)愈傷組織，農(nóng)桿菌侵染愈傷組織的過(guò)程中，進(jìn)行真空減壓。隨后的共培養(yǎng)階段，并不使用培養(yǎng)基，而是直接將愈傷組織放在一張濾紙上進(jìn)行干燥處理。共培養(yǎng)之后，沒(méi)有直接進(jìn)入選擇培養(yǎng)階段，而是將愈傷培養(yǎng)在不含篩選抗生素的培養(yǎng)基上稍作休息，讓外源基因復(fù)蘇，再進(jìn)行篩選。同時(shí)在愈傷誘導(dǎo)和選擇階段添加脯氨酸。通過(guò)這樣的轉(zhuǎn)化流程，48.5%的Alamo愈傷組織和90.3%的Performer愈傷組織可以檢測(cè)出潮霉素抗性。筆者也通過(guò)真空滲透加干燥的處理方法，得到了40%以上的Alamo愈傷組織出苗率(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

有報(bào)道[26]稱，農(nóng)桿菌侵染前將愈傷組織置于3% 麥芽糖、300 μmol·L-1谷氨酰胺 (Gln)溶液中冰浴20 min，隨后的轉(zhuǎn)化中，也采取真空、干燥處理，結(jié)果表明，AlamoⅡ型愈傷組織轉(zhuǎn)化效率可達(dá)72%，Performer轉(zhuǎn)化率高達(dá)96%；即使是高地型品種Blackwell也獲得成功轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率為5.6%。一些柳枝稷轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的結(jié)果如表1所列，可以看出，即使是同一個(gè)品種、不同實(shí)驗(yàn)室、不同轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)化率也不盡相同。但值得注意的是，不同文獻(xiàn)采用的轉(zhuǎn)化率計(jì)算方法也不完全一致。

1.2 基因型對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化的影響

柳枝稷因其原產(chǎn)地緯度不同，可以分為低地和高地生態(tài)型[33-34]。低地生態(tài)型起源于低緯度地區(qū)，喜好溫暖濕潤(rùn)的氣候環(huán)境，其株型高大，生物量高，但耐寒性差，主要品種有Alamo、Performer、Bomaster、Kanlow和Colony等。髙地生態(tài)型起源于較高緯度地區(qū)，其莖稈略微細(xì)矮，生長(zhǎng)較慢，生物量較低，但抗旱、耐寒能力強(qiáng)，其品種有Blackwell、Cave-in-Rock、Trailblazer、Carthage和Shawnee等[35]。

柳枝稷染色體基數(shù) x = 9，它的倍性從 2 n =18 到 2 n = 108 都有分布，最常見(jiàn)的倍性是 2 n = 4 x =36 和 2 n = 8 x = 72 兩種[36-38]。由于基因型不同，不同柳枝稷品種的組培再生能力及遺傳轉(zhuǎn)化效率明顯不同[39]。劉燕蓉和張萬(wàn)軍[40]對(duì)11個(gè)不同生態(tài)型柳枝稷品種進(jìn)行組織培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)分析其愈傷組織形態(tài)及比例，結(jié)果表明，低地型品種Alamo和Performer的種子發(fā)芽率和愈傷誘導(dǎo)率均較低，但容易分化、色澤鮮亮、結(jié)構(gòu)松脆的Ⅱ型愈傷組織比例高；雖然高地型品種Dacotach、Blackwell和Nebraska 28的愈傷誘導(dǎo)率和種子發(fā)芽率較高，但Ⅱ型愈傷組織較少，不易獲得組培再生苗。

表1 柳枝稷遺傳轉(zhuǎn)化方法Table 1 The method of genetic transformation of switchgrass

Ogawa等[27]誘導(dǎo)柳枝稷種子形成結(jié)構(gòu)致密、生長(zhǎng)較慢的Ⅰ型愈傷組織，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化低地品種Alamo、Kanlow以及高地品種Trailblazer，但在該試驗(yàn)所采用條件下，高地品種Blackwell、Cave-in-Rock不能產(chǎn)生Ⅰ型愈傷組織。目前柳枝稷轉(zhuǎn)基因研究常選用低地型品種，如Alamo。高地型品種由于基因型復(fù)雜等原因，愈傷組織再生及遺傳轉(zhuǎn)化均較低地型困難。

2 柳枝稷功能基因改良

2.1 降低木質(zhì)素含量

植物生物質(zhì)的主要成分為木質(zhì)纖維素，包括半纖維素、纖維素和木質(zhì)素等。木質(zhì)素不但難以轉(zhuǎn)化利用，而且還影響纖維素的生物降解。有研究指出，木質(zhì)素含量為22%的原料可產(chǎn)生的糖只有木質(zhì)素含量為17%的原料的一半，木質(zhì)素含量為26%的原料幾乎不產(chǎn)糖[41]。因此植物生物質(zhì)必須經(jīng)過(guò)預(yù)處理破壞木質(zhì)素對(duì)纖維素的包裹[42]，纖維素和半纖維素才可通過(guò)水解和發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)乙醇。柳枝稷的木質(zhì)素含量為17.56%，與常見(jiàn)的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物玉米秸(18.59%)、麥稈(16.85%)木質(zhì)素含量持平(表2)。如果采用生物技術(shù)適當(dāng)降低木質(zhì)素含量，就可以更好地利用柳枝稷的生物質(zhì)[43]。

表2 一些常見(jiàn)能源植物的物質(zhì)組成Table 2 Composition of some prospective energy crops

肉桂醇脫氫酶(CAD)是木質(zhì)素合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控酶，它可以將木質(zhì)素前體轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素單體。已有報(bào)道通過(guò)下調(diào)柳枝稷CAD基因的表達(dá)，降低柳枝稷體內(nèi)木質(zhì)素的含量，從而使柳枝稷中糖化效率達(dá)到23%，并且不需要酸預(yù)處理[29, 44]。類似的可以降低木質(zhì)素含量的酶還有咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)。木質(zhì)素是由多種芳香醇單體形成的一種復(fù)雜酚類聚合物，COMT是參與苯丙酸途徑中的一個(gè)甲基化酶。Fu等[45]下調(diào)了COMT基因的表達(dá)，在沒(méi)有酸預(yù)處理的情況下，糖化效率增加了 29.2%～38.3%。然而有研究指出, 下調(diào)COMT的柳枝稷中低分子量酚類化合物會(huì)抑制糖化作用以及釀酒酵母的發(fā)酵[46]。另有研究表明，MYB家族轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物木質(zhì)素生物合成過(guò)程，對(duì)植物木質(zhì)素含量及結(jié)構(gòu)都起到了重要作用。Shen等[47-48]在柳枝稷中過(guò)表達(dá)了R2-R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的PvMYB4，在未經(jīng)酸預(yù)處理的條件下就可以使糖化效率增加300%，最終使纖維素乙醇產(chǎn)量比普通植株提高了2.6倍。

2.2 提高生物量

MicroRNA(miRNA)是真核生物及病毒中存在的由19～24 nt組成的一類內(nèi)源性非編碼的單鏈小RNA，能夠識(shí)別并指導(dǎo)靶基因的降解或者抑制靶基因的翻譯。已有研究表明，miRNA廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、形態(tài)建成及激素代謝等各種過(guò)程[49]。miR156是植物中鑒定的第1個(gè)miRNA，在柳枝稷中miR156通過(guò)調(diào)控植物特有的一類多功能的轉(zhuǎn)錄因子家族SPL (SQUAMOSA promoter binding like)控制植物發(fā)育階段。Fu 等[50]利用基因工程的方法過(guò)表達(dá)了miR156b前體基因，在較低的miR156表達(dá)水平下，柳枝稷可以正常開(kāi)花，并且生物量增加了58%～101%。

蔗糖合成酶(SUS)催化蔗糖和UDP轉(zhuǎn)變?yōu)閁DP-葡萄糖和果糖，UDP-葡萄糖又可在纖維素合成蔗糖合成酶(SUS)催化蔗糖和UDP轉(zhuǎn)變?yōu)閁DP-葡萄糖和果糖，UDP-葡萄糖又可在纖維素合成酶作用下轉(zhuǎn)變成組建細(xì)胞壁的纖維素。Poovaiah等[31]鑒定了4個(gè)柳枝稷SUS，過(guò)表達(dá)pvSUS1的轉(zhuǎn)基因柳枝稷，植株高度增加37%，生物量增加13.6%。

2.3 抵抗逆境脅迫

自然環(huán)境中的植物，經(jīng)常受到生物脅迫，比如病原菌的侵染。同時(shí)因其不可移動(dòng)性，還要忍受干旱、洪澇、低溫以及鹽堿等非生物脅迫。研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA在抵抗逆境脅迫中發(fā)揮了重要的作用[51]。Matts等[52]利用生物信息學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)生物學(xué)的方法，鑒定了20個(gè)柳枝稷保守miRNA家族，預(yù)測(cè)了37個(gè)miRNA的靶基因。通過(guò)對(duì)miR395和miR399表達(dá)模式的分析，并且比較了它們?cè)跀M南芥(Arabidopsis thaliana)和蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)miRNA與柳枝稷在貧瘠土壤中的生長(zhǎng)適應(yīng)性有關(guān)。

Xie等[53]對(duì)柳枝稷進(jìn)行了干旱和鹽處理，隨后用測(cè)序的方法在該材料中鑒定出17個(gè)與干旱有關(guān)的 miRNAs，其中 4個(gè)是保守的 miRNAs，另外13個(gè)是柳枝稷特有的miRNAs。另有研究從柳枝稷中克隆了Pvi-MIR319a，并且用反向遺傳學(xué)的方法研究了它的功能[54]。過(guò)表達(dá)Pvi-MIR319a的水稻表現(xiàn)出葉片寬大、植株矮小、開(kāi)花延遲等表型，說(shuō)明該基因?qū)χ仓臧l(fā)育具有重要的調(diào)控作用，因此Pvi-MIR319a也被認(rèn)為是柳枝稷遺傳改良的良好候選基因。

多年生柳枝稷因其具有較高木質(zhì)纖維素含量而成為生物能源生產(chǎn)的重要原料。如果通過(guò)代謝工程和基因工程進(jìn)一步降低木質(zhì)素含量，增加產(chǎn)量，提高抗脅迫能力，將使柳枝稷成為更為理想的能源作物。目前柳枝稷基因工程概況如表3所列。

表3 柳枝稷基因工程概況Table 3 Summary of genetic modifications of switchgrass

3 研究展望

植物基因工程是把特定基因引入到宿主細(xì)胞，并整合到宿主基因組，從而改變宿主的遺傳組成，產(chǎn)生具有特定性狀的轉(zhuǎn)基因植物。該技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)育種方法的有益補(bǔ)充，也是改善作物品質(zhì)、提高作物產(chǎn)量的重要手段。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在大豆(Glycine max)、玉米、棉花(Gossypium hirsutum)、油菜(Brassica campestris)等植物中廣泛應(yīng)用，生產(chǎn)出了抗蟲(chóng)、抗病、抗除草劑等多個(gè)品種，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。將基因工程技術(shù)應(yīng)用到柳枝稷中，從而增加燃料乙醇的生產(chǎn)率，也必將成為柳枝稷育種的重要方面[55-56]。

柳枝稷的重要應(yīng)用價(jià)值是生產(chǎn)纖維素乙醇，但實(shí)際生產(chǎn)中遇到了二代乙醇生產(chǎn)成本過(guò)高的問(wèn)題。成本消耗在預(yù)處理、糖化、發(fā)酵等各個(gè)步驟。通過(guò)基因工程，改變柳枝稷結(jié)構(gòu)組成，簡(jiǎn)化生產(chǎn)步驟，降低成本，可為開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)可行的生產(chǎn)工藝奠定基礎(chǔ)?？尚械牧︷⑦z傳工程改造包括降低木質(zhì)素含量，改變細(xì)胞壁中糖的組成，從而使糖可以最大限度轉(zhuǎn)化成為生物燃料。也有學(xué)者提出可以降低細(xì)胞壁交聯(lián)來(lái)增加有效生物質(zhì)[43]。所有這些工作都需要對(duì)柳枝稷進(jìn)行系統(tǒng)的功能基因組學(xué)研究，詳細(xì)了解各基因功能及其代謝調(diào)控，才能篩選出目的基因。Okada等[57]以柳枝稷Kanlow為母本、Alamo為父本進(jìn)行雜交，雜交后代利用SSR標(biāo)記繪制了遺傳圖譜。USDOE-JGI基于Roche 454和Illumina平臺(tái)對(duì)柳枝稷開(kāi)展了全基因組測(cè)序分析，致力于提供重要功能區(qū)域準(zhǔn)確、全面的參考基因組信息，目前已經(jīng)獲得的序列信息公布于網(wǎng)站http://switchgrassgenomics.org/[58]。柳枝稷基因組研究的開(kāi)展，有助于發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞壁組成、作物產(chǎn)量和其他抗逆性相關(guān)的基因?？茖W(xué)家通過(guò)比較柳枝稷和水稻、高粱及其他植物的基因組數(shù)據(jù)，可以更好地理解柳枝稷基因組，為柳枝稷提供更多的生物燃料奠定堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。