坡耕地土壤微生物功能多樣性對間作體系的響應(yīng)

許建晶，羅珠珠，陳 英

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省干旱生境作物學(xué)省部共建國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

間作種植模式在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已被廣泛研究與應(yīng)用，合理的間作可明顯提高作物產(chǎn)量[1]、防治病蟲害[2-3]以及改善根際營養(yǎng)條件[4]，還可以規(guī)避市場風(fēng)險，帶來經(jīng)濟效益[5]。目前，間作物種根系之間和根際微生物之間的相互作用已成為間作研究的重點。相關(guān)研究表明，土壤根際微生物群落的組成受土壤形態(tài)、植物種類的影響[6]，在間作模式下，不同作物的根系直接接觸，根系周圍的微生物之間也會相互作用，對彼此產(chǎn)生影響。該結(jié)果可能是兩種作物根際微生物群落共同發(fā)揮作用導(dǎo)致的，也可能是其中一種植物根際微生物主導(dǎo)整個土壤體系發(fā)揮作用。國內(nèi)學(xué)者針對玉米(Zea mays) || 馬鈴薯 (Solanum tuberosum)[7]、桑樹 (Morus) ||苜蓿 (Medicago)[8]、小麥 (Triticum aestivum) || 苜蓿[9]和小麥 ||蠶豆 (Vicia faba)[10]等不同種類作物間作模式的研究均表明，間作種植可明顯提高根際土壤微生物的生理活性，促進對土壤碳源的利用，從而提升土壤微生物群落功能多樣性。

隴中黃土高原地區(qū)水土流失嚴重，土地生產(chǎn)力低下，同時，成片的丘陵溝壑區(qū)限制了農(nóng)業(yè)機械化的實施。因此，選擇適宜的間作種植模式引入到當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐，能夠利用不利的地形特點進行農(nóng)業(yè)增收。馬德舉等[11]認為，間作物種的選擇應(yīng)該符合3個原則：1)區(qū)域適應(yīng)性強，2)生態(tài)效應(yīng)好，3)具有一定的經(jīng)濟效益。楊遠祥等[12]認為間作植物應(yīng)根系深、耐干旱貧瘠。因此，因地制宜選擇合理的間作作物對區(qū)域的長遠發(fā)展具有重要意義。甘草(Radix glycyrrhizae)和菘藍(Isatis tinctoria)是干旱、半干旱地區(qū)重要的耐旱植物資源，也是常用的大眾藥材，紫花苜蓿(Medicago sativa)是多年生牧草植物，對抑制水土流失、改善土壤結(jié)構(gòu)起到重要的作用。因此，本研究選擇甘草、菘藍、紫花苜蓿分別與旱作春小麥間作，利用Biolog微孔板鑒定技術(shù)，研究不同間作模式下土壤根際微生物群落對土壤碳源利用模式的變化，從土壤微生物群落功能多樣性角度解釋不同間作模式對土壤微生物功能多樣性的影響，以期豐富間作系統(tǒng)的研究理論，并為西部黃土高原雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)生產(chǎn)力可持續(xù)發(fā)展提供理論參考。

1 研究區(qū)概況與研究方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗地位于甘肅省定西市李家堡鎮(zhèn)，研究區(qū)屬黃土高原丘陵溝壑區(qū)，山多川少、地形破碎、水土流失嚴重。該區(qū)屬中溫帶半干旱區(qū)，平均海拔2 000 m，年均太陽輻射 592.9 kJ·cm-2，日照時數(shù)2 476.6 h，年均氣溫 6.4 ℃，≥ 0 ℃ 年積溫 2 933.5℃·d，≥ 10 ℃ 年積溫 2 239.1 ℃·d；無霜期 140 d，年均降水量 390.9 mm，年蒸發(fā)量 1 531 mm，干燥度2.53，為典型的雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)。地帶性土壤為黃綿土，土質(zhì)綿軟，土層深厚，質(zhì)地均勻，儲水性能良好。研究區(qū)土壤基本理化性質(zhì)為，土壤容重1.24 kg·m-3，有機質(zhì) 7.25 g·kg-1，全氮 0.83 mg·kg-1，全磷 1.83 mg·kg-1，全鉀 18.38 g·kg-1，pH 8.32。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗設(shè)計

試驗設(shè)在一塊6°～8°的緩坡地塊上。以甘草、菘藍兩種地道藥用經(jīng)濟作物和紫花苜蓿及旱作春小麥為供試作物，甘草、菘藍、紫花苜蓿與旱作春小麥帶狀種植。其中旱作春小麥與菘藍均于2017年3月中旬播種，旱作春小麥于同年7月下旬收獲，菘藍于10月初收獲，甘草和紫花苜蓿為多年生作物(2015年試驗設(shè)置初種植)。試驗田間布置如圖1所示。

試驗小區(qū)呈“S”型分布，每個小區(qū)面積為5 m ×8 m，共設(shè)有4個處理，每個處理3次重復(fù)。各處理分別為小麥單作 (Wheat, W) (Plot1、Plot5、Plot10)：無植物籬，小麥采用當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)耕作方式；小麥 || 甘草 (籬 )間 作 (Wheat || Liquorice, W || L) (Plot2、Plot8、Plot11)：帶寬 4 m，甘草 (籬)、小麥幅寬均為 2 m， 每 小 區(qū) 各 兩 帶 ； 小 麥 || 菘 藍 (籬 )間 作(Wheat || Woad, W || I) (Plot3、Plot7、Plot12)：帶寬 4 m，菘藍(籬)、小麥幅寬均為2 m，每小區(qū)各兩帶；小麥 || 苜 蓿 (籬 )間 作 (Wheat || Alfalfa, W || A) (Plot4、Plot6、Plot9)：帶寬 4 m，苜蓿 (籬)、小麥幅寬均為2 m，每小區(qū)各兩帶。

1.2.2 土壤樣品的采集與測定

圖1 試驗小區(qū)田間布置Figure 1 Experiment plot field layout

定位試驗設(shè)置于2015年，2017年4月春小麥苗期，利用五點法采集12個試驗小區(qū)0-10 cm、10-30 cm土層的供試土樣，間作處理下的土壤在小麥和間作作物的交匯地帶(2 m內(nèi))采集。將采集的土樣混合均勻，并過2 mm的篩除去土樣中的植物根系、落葉、石塊等，然后裝入小號密封袋中置于4 ℃冰箱保存，在一周內(nèi)進行土壤微生物功能多樣性指標的測定。

1.2.3 土壤微生物碳源代謝功能及其相關(guān)指數(shù)的計算

（3）信息共享化。將BIM技術(shù)應(yīng)用于建筑工程項目管理中，可以從建筑工程項目設(shè)計始，至建筑工程項目完成均可以通過計算機技術(shù)模擬，甚至是建筑項目工程的廢棄拆除全過程，利用BIM技術(shù)能夠?qū)⒔ㄖこ添椖咳^程實現(xiàn)在業(yè)主方、施工方等多方信息共享，對提升建筑工程施工決策的科學(xué)化水平具有積極的現(xiàn)實意義。

采用 Biolog 生態(tài)微平板 (BIOLOG Eco Plate TM)測定[13]。通過測定各個生態(tài)板孔的吸光值隨著培養(yǎng)時間的變化，反映微生物群落功能多樣性。稱取相當(dāng)于10 g干土的鮮土樣放入裝有 90 mL 0.85%的NaCl無菌溶液的三角瓶中，加無菌棉花置于搖床上振蕩30 min后，在制備好的懸液中加入NaCl溶液，配制成稀釋比例為1∶100的Eco板接種液(將Biolog-eco板從冰箱里取出，在25 ℃條件下活化24 h)。在超凈工作臺上，將準備好的樣品溶液接種于Eco微平板上，將接種好的微孔板放在保濕的容器中，并放入25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗連續(xù)培養(yǎng)216 h(9 d)，培養(yǎng)期間每隔 24 h 用反應(yīng)微平板讀數(shù)器在590 nm處讀數(shù)，直至讀數(shù)不再變化為止。

生物代謝強度采用平均顏色變化率(average well color development, AWCD)表征計算公式如下：

式中：Ci為各反應(yīng)孔在590 nm下的光密度值；R為Eco板對照孔的光密度值；Ci-R ＜ 0的孔均在計算中記為零，即Ci-R均 ≥ 0。采用孔平均顏色變化率法測定土壤微生物利用單一碳源的能力。

將培養(yǎng)96 h獲得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(D)以及McIntosh均勻度指數(shù)(U)表征微生物群落代謝功能的多樣性，計算公式如下：

式中：Pi為第i孔的相對吸光值與平板所有反應(yīng)孔相對吸光值總和的比率，即 Pi= (Ci- R)/Σ(Ci- R);ni為第i孔的相對吸光值。

土壤微生物群落Richness豐富度指數(shù)(S)采用反應(yīng)孔(吸光值 ＞ 0.2，則代表該孔的碳源被利用，該孔為反應(yīng)孔)的數(shù)目表示[14]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 不同處理的土壤微生物平均顏色變化率

AWCD作為反映土壤微生物群落利用單一碳源的重要指標，隨著培養(yǎng)時間的變化曲線可以揭示土壤微生物群落的代謝強度[15]。圖2顯示了間作定位試驗在4種不同處理下0-10 cm、10-30 cm土層AWCD隨培養(yǎng)時間的變化情況?？偟淖兓厔荩翰煌幚硐翧WCD均隨培養(yǎng)時間的延長而增長，即微生物利用碳源的總量呈增長趨勢，但各處理下AWCD增長幅度不同；各處理下AWCD隨土層深度增加而減小，土層越深，微生物利用碳源的總量就越少；在0-24 h內(nèi)，AWCD均無明顯變化，說明在24 h內(nèi)，碳源基本未被利用；培養(yǎng)24 h后，土壤微生物逐漸適應(yīng)BIOLOG微平板基質(zhì)環(huán)境進入對數(shù)增長期。W || I處理下的AWCD在整個研究土層均高于其他處理，統(tǒng)計分析表明：在10-30 cm 土層，W || I處理下的 AWCD 在培養(yǎng)的增長期同同 W ||L 處理差異顯著 (P＜0.05) 。由以上分析可以得知，采用小麥||菘藍間作處理可以提高土壤微生物的碳源利用能力和整體代謝活性。

2.2 不同處理的土壤微生物群落指數(shù)

圖2 土壤微生物群落AWCD隨培養(yǎng)時間的變化Figure 2 AWCD changes with different incubation times

表1 土壤微生物群落指數(shù)(96 h)Table 1 Diversity indices of soil microbial communities of 96 h

土壤微生物群落對基質(zhì)碳源的利用程度可以采用多樣性指數(shù)表示，結(jié)果表明(表1)，微生物培養(yǎng)96 h 時，在 10-30 cm 土層 W || L 與 W || I的 AWCD值差異顯著(P＜0.05)。4種指數(shù)均隨土層深度增加而逐漸變小，但在 0-10 cm、10-30 cm土層中Shannon-Wiener和Simpson指數(shù)在小麥單作和間作之間均無顯著差異(P ＞ 0.05)；而McIntosh指數(shù)表現(xiàn)為小麥單作和間作差異顯著(P＜0.05)，其中0-10 cm土層土壤 W || L 和 W || I顯著高于單作，10-30 cm土層以W || I效果顯著顯著高于單作；Richness指數(shù)則表現(xiàn)為間作 ＞ 單作，在 0-10 cm 土層 W 與 W || I差異顯著 (P＜0.05)。與小麥單作相比，小麥 || 菘藍間作可以提高0-10 cm土壤的均勻度和豐富度指數(shù)。

2.3 不同處理的土壤微生物對碳源利用模式的變化

4種不同處理下土壤微生物對六大類碳源的利用強度如圖 3所示。0-10 cm 土層，W || L 處理下土壤微生物對羧酸類、多聚物、糖類和氨基酸這4類碳源的利用強度分別是W的 1.35、1.39、1.45和 1.24倍；W || I處理下土壤微生物對羧酸類、糖類、酚酸類和氨基酸類碳源的利用強度分別是W處理的1.8、1.3、2和1.2倍；W || A處理對六大類碳源的利用強度與W差別不大。在多聚物和糖類的利用強度上，W || L處理顯著高于W ||A 處理 (P＜0.05)，而 W || I處理下酚酸類的利用強度顯著高于 W 和 W || A 處理 (P＜0.05)。在 10-30 cm土層，W || I處理下土壤微生物對六大類碳源的利用強度均高于W處理，分別是W的1.3、1.1、1.4、5.2、1.1和 2.3倍；W || A 處理對羧酸類和胺類碳源的利用強度高于W處理。在酚酸類的利用強度上，W 和 W || L 處理差異顯著不顯著 (P ＞ 0.05)，二者顯著低于 W || I和 W || A 處理 (P＜0.05)；在胺類的利用上 W || I處理顯著高于 W || L 處理 (P＜0.05)。

2.4 土壤微生物對碳源利用多樣性的主成分分析

主成分分析是處理數(shù)學(xué)降維的一種方法，將多個變量通過線性變換以選出較少個數(shù)重要變量。主成分個數(shù)的提取原則是相對應(yīng)特征值 ＞ 1的前幾個主成分。根據(jù)此原則本研究在0-10 cm土層的31個因子中提取了5個主成分，累計貢獻率達到92.85%，其中PC1為53.12%，權(quán)重最大，PC2次之，為14.65%，PC3～PC5較??；10-30 cm土層提取了6個主成分，累計貢獻率達到95.39%，其中PC1為42.92%，權(quán)重最大，PC2次之，為18.74%，PC3～PC6較小?？梢姡魍翆泳憩F(xiàn)為前2個主成分是變異的主要來源，能夠解釋絕大部分變異，故本研究選取前2個主成分來表征微生物群落碳源代謝特征，以此解釋微生物群落利用碳源的功能多樣性。

圖3 不同處理下土壤微生物對6類碳源的利用強度Figure 3 Utilization intensity of microbes to six types of carbon source in different treatments

圖4 土壤微生物碳源利用圖譜主成分分析Figure 4 Principal component analysis of carbon sources utilization of soil miccrobes

0-30 cm土層的PCA分析圖譜如圖4所示，0-10 cm 土層，在 PC1軸上，W || L 分布在正方向，得分區(qū)間為 0.98～1.28，W || A 分布在負方向，得分區(qū)間-1.20～-0.80，而 W 和 W || I其主體都分布在負方向；在PC2軸上，W || L(-0.42～-0.33)和 W || A(-0.97～-0.27)得分值都為負值，W || I的得分為正，區(qū)間在0.68～1.32，W的得分為-1.42～2.4）。10-30 cm 土層，在 PC1軸上，W ||I和W || A分布在正方向，得分區(qū)間為0.34～2.04，W || L 分布在負方向，得分區(qū)間在-0.43～-0.14，W主體均在正方向；在PC2軸上，除W || L分布在正方向外，其他處理在正負方向都有分布。從分布象限上看，0-10 cm 土層，W || L 的投射點分布在第四象限，W || I與 W || A、W 的投射點主體分布在第二、三象限；10-30 cm 土層，W || L 的投射點分布在第二象限，W || I、W || A 和 W 的投射點主要分布在第一、四象限。這表明W || L在耕層0-30 cm土壤與其余各處理在空間分布上有較明顯的距離，甘草的種植導(dǎo)致了土壤微生物群落代謝功能的變化。

研究同時發(fā)現(xiàn)，在 0-30 cm 土層，W || L、W || I與W || A在PC軸上的空間分布離散度較小，這說明在甘草、菘藍、苜蓿間作的影響下土壤微生物群落穩(wěn)定性強，因為甘草、菘藍、苜蓿的根系都比較發(fā)達，其提供了大量分泌物和碳源，維持了土壤微生物群落穩(wěn)定性的生存環(huán)境，而W得分系數(shù)差異很大，其土壤微生物群落穩(wěn)定性差。

2.5 土壤微生物碳源利用載荷因子分析

不同種植模式下土壤微生物碳源利用能力存在差異，且不同處理下主成分軸上的差異與聚集在該軸上微生物利用碳源底物的能力相關(guān)聯(lián)。主成分的初始載荷因子反映了微生物對土壤碳源利用和所提取主成分之間相關(guān)性的大小。載荷因子為正值，二者正相關(guān)，反之則為負相關(guān)。碳源的初始載荷因子絕對值越大，說明該碳源對微生物代謝的影響越大[16]。本研究選取載荷因子大于0.5的碳源作為與PC1和PC2顯著相關(guān)的碳源[11]。從表2可以看出，在0-10 cm土層范圍內(nèi)，第一主成分PC1荷載因子在0.5以上的有19種基質(zhì)碳源，其中因子載荷在0.8以上的有14種，糖類5種、氨基酸類3種、羧酸類3種、多聚物2種，胺類1種，其中N-乙酰-D-葡萄糖的載荷因子最大，為0.911；第二主成分PC2的荷載因子在0.5以上的有18種碳源，分別為氨基酸類5種、羧酸類2種、酚酸類2種、糖類6種，載荷因子最大的是α-D-葡萄糖-1-磷，說明糖類碳源對0-10 cm土層內(nèi)土壤微生物的碳代謝影響最大。同理，糖類和多聚物類碳源對10-30 cm土層內(nèi)土壤微生物的碳代謝影響最大。在0-30 cm土層內(nèi)土壤微生物的碳代謝影響隨土層深度的增加而降低。所以，0-30 cm土層土壤微生物對糖類碳源物質(zhì)能力不同導(dǎo)致土壤微生物生理曲線的差異。

3 討論

糧草(藥)間作定位試驗表明：AWCD變化符合微生物常規(guī)生長曲線，小麥 || 菘藍間作的AWCD值在0-30 cm土層高于小麥單作；與小麥單作相比，間作甘草和菘藍可以顯著提高McIntosh指數(shù)；甘草的種植導(dǎo)致了土壤微生物群落代謝功能的變化；糖類是土壤微生物利用的主要碳源，而小麥 || 苜蓿間作提高了0-30 cm土層土壤微生物對羧酸類碳源的利用比例。

AWCD隨培養(yǎng)時間的變化曲線可以反映土壤微生物群落的代謝特征，用以比較微生物利用碳源的速度[17]。本研究結(jié)果表明，4種處理下AWCD隨著培養(yǎng)時間的延長表現(xiàn)為微生物常規(guī)生長曲線，即“S”型增長，說明土壤微生物利用碳源的能力隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)而逐漸增強。AWCD值越高，土壤微生物利用碳源底物的能力越強[18]，在整個培養(yǎng)過程中，小麥 || 菘藍間作的AWCD值在0-30 cm土層都高于小麥單作，由此可見，采用菘藍間作種植模式可以提高土壤微生物群落代謝能力，促進土壤微生物對底物碳源的利用能力。小麥與菘藍共生期間，一方面根系分泌物的質(zhì)量和數(shù)量均增加，間作小麥不僅會分泌蘋果酸和檸檬酸，還會分泌乙酸、丁二酸和草酸等，根系分泌物引起土壤微生物數(shù)量和微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。另一方面選擇間作的菘藍系根系發(fā)達植物，能夠吸收深層養(yǎng)分。但采用不同作物間作效果是不同的，張桂國等[19]研究苜蓿 || 玉米間作時發(fā)現(xiàn)，苜蓿的固氮作用會加強玉米根系對氮元素的吸收，從而使玉米表現(xiàn)為間作產(chǎn)量優(yōu)勢；而朱靜等[20]的研究則發(fā)小麥分泌物丁香酚可加劇間作模式的化感抑制作用。微生物利用碳源的能力隨著土層深度的增加而降低。

多樣性指數(shù)能夠比較微生物群落的功能多樣性差異。逢好勝等[21]在研究小麥 || 苜蓿間作對 0-5 cm土壤微生物群落功能多樣性的影響時指出間作苜蓿和間作小麥可以提高土壤微生物群落McIntosh指數(shù)。本研究結(jié)果表明，在0-10 cm土層，與小麥單作相比，間作甘草和菘藍可以顯著提高McIntosh指數(shù)，間作苜蓿下的McIntosh指數(shù)則低于小麥單作，但隨著土層加深，間作苜蓿的McIntosh指數(shù)開始顯著高于單作小麥。由于苜蓿根系發(fā)達，其對土壤生化性質(zhì)的影響可能在深層土壤表現(xiàn)更為明顯。間作甘草和菘藍可以提高表層(0-10 cm)土壤微生物群落Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)，但與小麥單作的差異并不顯著，這可能是由于試驗?zāi)晗掭^短所致，還需后期進一步研究。

主成分分析可以解釋不同處理土壤微生物對碳源利用的差異[16]。在本研究結(jié)果中，小麥 || 甘草集中分布于主成分圖譜，表明甘草的種植導(dǎo)致了土壤微生物群落代謝功能的變化。間作使土壤微生物群落穩(wěn)定性增強。由于植物在生長發(fā)育過程中向根部不斷釋放各種有機物質(zhì)，不但能調(diào)節(jié)植物對礦質(zhì)元素的吸收和抵御外界環(huán)境壓迫，而且能維持土壤微生物的活性[22]；兩種植物間作，由于植物的種間競爭和種間促進作用[23]，會改變植物根系分泌物的含量和成分組成，就勢必會影響到土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)和功能，即改變了土壤微生物群落功能利用能力和碳源的利用種類。本研究結(jié)果表明：糖類是土壤微生物利用的主要碳源，而小麥 || 苜蓿間作使得0-30 cm土層土壤微生物對羧酸類碳源的利用比例大幅度提高，可見，在根系的交互作用影響下，有利于土壤中羧酸類碳源的微生物種群增長。

綜合土壤微生物對碳源利用的動力學(xué)特征、土壤微生物多樣性指數(shù)以及碳源利用多樣性主成分分析的結(jié)果，與單作相比，糧草(藥)間作種植在提高土壤微生物功能多樣性，維系群落穩(wěn)定性、改善土壤質(zhì)量方面具有明顯優(yōu)勢。