梔子提取物分離純化工藝研究

崔龍 胡少銀 劉和平

[摘要] 目的 優(yōu)選梔子提取物的分離純化工藝參數(shù)。 方法 以西紅花總苷轉(zhuǎn)移率和色價(jià)為綜合評(píng)分指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選梔子提取物的最佳分離純化工藝參數(shù)，并進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)驗(yàn)證。 結(jié)果 最佳分離純化工藝為：提取液以0.5 mg/mL的濃度上HPD-100A樹(shù)脂吸附，依次用12 BV純化水、2 BV的35%乙醇以1 BV/h的流速洗脫除雜，再以同樣的流速用4 BV的65%乙醇洗脫即得梔子提取物。最佳工藝條件下進(jìn)行中試生產(chǎn)驗(yàn)證，3批梔子提取物的西紅花總苷轉(zhuǎn)移率、色價(jià)和產(chǎn)率均值分別為86.25%、509.82和2.11%，其RSD值分別為1.56%、0.39%和2.33%。 結(jié)論 該梔子提取物分離純化工藝經(jīng)過(guò)工業(yè)化生產(chǎn)驗(yàn)證，穩(wěn)定、可靠。

[關(guān)鍵詞] 梔子;梔子提取物;西紅花苷;柱層析

[中圖分類(lèi)號(hào)] R286.0? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）01（a）-0033-05

梔子提取物是重要的藥物合成原料及中間體，其制劑血脈清片具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及抗腫瘤等作用[1-3]，臨床上常用于治療高脂血癥[4-5]。梔子提取物是以茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的果實(shí)為原料，經(jīng)提取、精制而成的橙紅色至暗棕紅色的粉末，主要含有西紅花苷、西紅花酸，還有少量環(huán)烯醚萜苷類(lèi)的梔子苷及黃酮、綠原酸等化學(xué)成分[6];其水溶液在紫外-可見(jiàn)光區(qū)440 nm處有特征吸收峰[7]。目前，梔子提取物的制備工藝研究鮮有報(bào)道，而食品添加劑梔子黃的分離純化研究報(bào)道較多，主要有溶劑提取法、萃取技術(shù)、膜分離技術(shù)、柱層析純化等多種制備方法[8]，但僅有柱層析法普遍應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

梔子提取物和梔子黃的主要區(qū)別在于西紅花總苷和西紅花苷-Ⅰ的含量。梔子黃中西紅花總苷含量與色價(jià)呈良好的正相關(guān)，且當(dāng)梔子黃的色價(jià)>500時(shí)，即符合梔子提取物的質(zhì)量要求。本研究以梔子為研究對(duì)象，以西紅花總苷轉(zhuǎn)移率、色價(jià)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用大孔吸附樹(shù)脂HPD-100A對(duì)梔子提取液進(jìn)行吸附，然后通過(guò)水、不同濃度的乙醇溶液解吸附，以期達(dá)到分離純化梔子提取物的目的。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MS205DU電子分析天平（梅特勒-托利多，0.01/0.1 mg）;UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[島津（中國(guó)）有限公司];N-3010旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀[埃朗科技國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司];CS101-2EBN電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;不銹鋼提取罐（陜西宏達(dá)實(shí)業(yè)有限公司）;HWZ系列單效外循環(huán)真空濃縮器（陜西宏達(dá)實(shí)業(yè)有限公司）;MCSZZ-20000不銹鋼樹(shù)脂柱（浙江明辰機(jī)械科技有限公司）;1500-IS振蕩篩（南京寶威干燥機(jī)械設(shè)備廠）;FZG低溫真空干燥烘箱（南京祿旺干燥設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111588-201303）;HPD-100A大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自滄州寶恩吸附材料有限公司;乙醇為藥用級(jí)，購(gòu)自中山市華士達(dá)化工有限公司;其余試劑均為分析純。

梔子果實(shí)（鮮梔子干燥品破碎成4～5 mm的顆粒），購(gòu)自安徽郎溪縣奕龍梔子種植專業(yè)合作社，經(jīng)國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)中心曹暉教授鑒定為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 西紅花總苷含量及色價(jià)的測(cè)定

按照陳陽(yáng)等[9-11]報(bào)道的方法測(cè)定梔子提取液或提取物的西紅花總苷含量及色價(jià)。

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備? 精密稱定西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品6.11 mg，置10 mL量瓶中，加50%乙醇溶液溶解、定容，即得西紅花苷-Ⅰ為0.5658 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備? 取梔子提取液或提取物適量，置200 mL量瓶中，加50%乙醇溶液定容至刻度，搖勻即得（若測(cè)定吸光度值不在0.3～0.7，則重新制備）。

2.1.3 測(cè)定法? 精密吸取西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品溶液適量，加50%乙醇溶液適量，定容，制成濃度分別為2.8289、3.5362、5.6579、7.0723、14.1447、28.2893 μg/mL的對(duì)照品溶液。以50%乙醇溶液為空白對(duì)照，測(cè)定對(duì)照品溶液在440 nm處的吸光度值（A），以A為縱坐標(biāo)，西紅花苷-Ⅰ濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程?；貧w方程為Y = 101.3800X+0.00591（r = 0.9999），西紅花苷-Ⅰ在2.8289～28.2893 μg/mL范圍線性關(guān)系良好。照上述方法，以50%乙醇溶液為空白對(duì)照，測(cè)定供試品溶液的西紅花總苷濃度，計(jì)算西紅花總苷含量及其轉(zhuǎn)移率。

2.1.4 色價(jià)? 以2.1.3項(xiàng)下測(cè)得的供試品溶液在440 nm處的吸光度值計(jì)算色價(jià)。色價(jià)=A×f/（100 m），其中A：供試品溶液在440 nm處的吸光度值;f：稀釋倍數(shù);m：試樣質(zhì)量（提取液以總固物計(jì)）。

2.2 HPLC測(cè)定西紅花苷-Ⅰ含量

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)? 梔子提取液及提取物中西紅花苷-Ⅰ按照劉和平等[12-14]報(bào)道的方法測(cè)定。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;以甲醇-水（60∶40）為流動(dòng)相，進(jìn)樣量：5 μL;流速：1.0 mL/min;柱溫：25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：440 nm。西紅花苷-Ⅰ的分離度>1.5，理論板數(shù)以西紅花苷-Ⅰ計(jì)≥2000。見(jiàn)圖1。

2.2.2 溶液制備? 對(duì)照品溶液制備：精密稱取西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL中含西紅花苷-Ⅰ 80 μg的溶液，精密量取3 mL，至100 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。供試品溶液制備：取梔子提取物10 mg，精密稱定，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液1 mL，置20 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 西紅花苷-Ⅰ的標(biāo)準(zhǔn)曲線? 分別精密量取濃度為86.77 μg/mL對(duì)照品溶液10、5 μL，濃度為8.677 μg/mL對(duì)照品溶液10、5、2.5 μL，以及濃度為0.8677 μg/mL對(duì)照品溶液20、10、5 μL，注入液相色譜儀中，按“2.2.1”色譜條件測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品的量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程Y = 20.122X-172.73，R2 = 0.9997。結(jié)果表明，西紅花苷-Ⅰ在4.3385～867.7 ng濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度? 取“2.2.2”項(xiàng)下的西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品溶液、供試品溶液，按上述“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄西紅花苷-Ⅰ的峰面積。其峰面積的RSD值分別為0.87%、0.56%，表明該方法精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性? 取梔子提取物及西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、1、3、6、12、24、48 h測(cè)定，記錄西紅花苷-Ⅰ的峰面積。其峰面積的RSD值分別為1.12%、1.54%，表明供試品溶液及對(duì)照品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性? 取梔子提取物，平行6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄西紅花苷-Ⅰ的峰面積。西紅花苷-Ⅰ的含量的RSD值為1.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率? 取西紅花苷-Ⅰ對(duì)照品，精密稱取50.325 mg，置于20 mL容量瓶中，加甲醇并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。另取已知含量的供試品，精密稱取9份，每份10 mg，平均分成3組，分別精密加入上述“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液1、2、3 mL，按上述“2.2.2”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算西紅花苷-Ⅰ的含量、加樣回收率、RSD值。結(jié)果平均回收率為98.48%，RSD為1.62%。見(jiàn)表1。

2.2.8 樣品含量測(cè)定? 取3批梔子提取物樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，分別制成供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

2.3 提取物提取濃縮、上樣液的制備

取已破碎的梔子干果，依次用6、4、4倍量的50%乙醇溶液在50℃水浴中浸提3次，每次2 h，每隔30 min攪拌1次。合并3次提取液，過(guò)300目篩網(wǎng)，即得梔子提取液，提取液經(jīng)減壓濃縮（≤70℃）至無(wú)醇味，再用純化水稀釋至1.0 g/mL（以生藥量計(jì)），備用。照2.1項(xiàng)下的方法測(cè)定提取液中西紅花總苷含量和色價(jià)分別為11.5 mg/mL和61.25。

2.4 提取物柱層析分離純化

2.4.1 樹(shù)脂的選擇及其預(yù)處理? HPD-100A樹(shù)脂是滄州寶恩吸附材料科技有限公司開(kāi)發(fā)的專門(mén)用于生產(chǎn)梔子提取物的非極性大孔吸附樹(shù)脂。根據(jù)既往對(duì)D101、D138、D3520、X-5、NKA-9、AB-8、HPD-400等多種樹(shù)脂的對(duì)比研究[15-20]，發(fā)現(xiàn)HPD-100A樹(shù)脂對(duì)梔子提取物有很好的吸附性和選擇性，故選擇HPD-100A大孔吸附樹(shù)脂。根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)，其預(yù)處理方法為：用95%乙醇浸泡樹(shù)脂24 h，取適量，裝柱，然后用5 BV的95%乙醇以2 BV/h的流速洗脫，最后用純化水以同樣的流速?zèng)_洗至無(wú)醇味，備用。

2.4.2 動(dòng)態(tài)吸附曲線的繪制及上樣量的確定? 取梔子提取液，以1 mL/min的流速上樣于已處理好的50 mL的HPD-100A樹(shù)脂，分段收集流出液（每段2.5 mL為1份），依次編號(hào)，共13份。照“2.1”項(xiàng)下測(cè)定流出液中的西紅花總苷的含量。流出液11中西紅花總苷含量明顯增加，故最佳生藥吸附量為0.25 g/mL（以樹(shù)脂體積計(jì)算）。見(jiàn)圖2。

2.4.3 提取物柱層析分離純化參數(shù)考察? 取經(jīng)預(yù)處理好的HPD-100A大孔吸附樹(shù)脂，濕法裝柱（柱徑高比1∶3、1∶5、1∶7），取不同濃度（1、0.5、0.33 g/mL）的梔子提取液以0.5 BV/h的流速上柱吸附。然后依次用12 BV純化水、2 BV低濃度乙醇（15%、25%、35%）和4 BV的65%乙醇洗脫，洗脫流速為1.0 BV/h，65%乙醇洗脫液即為梔子提取液。分別照2.1項(xiàng)下的方法測(cè)定梔子提取液中西紅花總苷含量及色價(jià)，計(jì)算西紅花總苷轉(zhuǎn)移率。①固定上樣濃度為1.0 g/mL、低濃度乙醇濃度為35%，與1∶5、1∶7比較，柱徑高比為1∶3時(shí)西紅花總苷的轉(zhuǎn)移率和色價(jià)明顯偏低。②固定上樣濃度為1.0 g/mL、柱徑高比1∶5，隨著洗脫的低濃度乙醇濃度的增加，西紅花總苷的轉(zhuǎn)移率和色價(jià)逐漸升高，同時(shí)西紅花總苷的損失也逐漸增加。③固定低濃度乙醇濃度為35%、柱徑高比1∶5，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，上樣濃度對(duì)西紅花總苷轉(zhuǎn)移率和色價(jià)的影響不大。綜合上述結(jié)果，選擇35%乙醇洗脫除雜，上樣濃度0.5 g/mL，柱徑高比1∶5分離純化梔子提取物。見(jiàn)表2。

2.4.4 提取物柱層析分離純化正交試驗(yàn)? 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以西紅花總苷轉(zhuǎn)移率和色價(jià)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以乙醇濃度、洗脫流速、洗脫量為考察因素設(shè)計(jì)正交表L9（34），優(yōu)選梔子提取物分離純化的工藝參數(shù)。本研究以西紅花總苷轉(zhuǎn)移率、色價(jià)兩個(gè)指標(biāo)綜合評(píng)分，權(quán)重分別為50%和50%。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3～4。由表4可知，對(duì)梔子提取物分離純化的影響大小順序?yàn)椋篈>B>C，即乙醇濃度影響最大;方差分析結(jié)果表明，各因素3個(gè)水平間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。故優(yōu)選的最佳純化工藝參數(shù)組合為A3B1C2，即乙醇濃度65%、洗脫流速1.0 BV/h、洗脫量4 BV。

2.4.5 提取物柱層析分離純化驗(yàn)證? 按照優(yōu)選的工藝參數(shù)在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了3批梔子提取物分離純化放大試驗(yàn)。3批驗(yàn)證試驗(yàn)西紅花總苷轉(zhuǎn)移率、色價(jià)和產(chǎn)率（以浸出物含量計(jì)算）均值分別為90.89%、506.99和2.37%，其RSD值分別為2.13%、0.25%和1.93%，說(shuō)明純化工藝穩(wěn)定、可靠。見(jiàn)表5。

2.5 梔子提取物分離純化中試生產(chǎn)

為驗(yàn)證上述梔子提取物純化工藝參數(shù)的穩(wěn)定性與可靠性，在最佳純化工藝參數(shù)條件下，進(jìn)行了3批中試生產(chǎn)驗(yàn)證。3批梔子提取物純化中試生產(chǎn)驗(yàn)證的西紅花苷總轉(zhuǎn)移率、色價(jià)和產(chǎn)率均值分別為86.25%、509.82和2.11%，其RSD值分別為1.56%、0.39%和2.33%，說(shuō)明該工藝合理可行，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。見(jiàn)表6。

2.6 梔子提取物中西紅花總苷和西紅花苷-Ⅰ的含量測(cè)定

按照“2.1”“2.2”項(xiàng)下測(cè)定3批中試樣品中西紅花總苷和西紅花苷-Ⅰ的含量。3批梔子提取物中西紅花總苷含量均>50%，西紅花苷-Ⅰ的含量均>25%，符合原料藥梔子提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。見(jiàn)表7。

3 討論

宋偉等[15]采用HPD-100A大孔吸附樹(shù)脂分離純化梔子黃色素，其提取液的色價(jià)從34.6升高到384.6，該研究采用水提取的梔子黃色素提取液的色價(jià)明顯較低。涂華等[21]利用AB-8、HPD-100A、D101等5種大孔吸附樹(shù)脂分離純化梔子黃色素，其提取物的色價(jià)高達(dá)489，但該研究采用的微波輔助提取法目前難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大生產(chǎn)。本研究以新鮮梔子干果為材料，采用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選了梔子提取物的分離純化方法，具體工藝參數(shù)：梔子提取液經(jīng)減壓濃縮至質(zhì)量濃度為0.5 g/mL的藥液，上HPD-100A大孔樹(shù)脂柱（柱徑比1∶5）吸附，生藥吸附量0.25 g/mL（以樹(shù)脂體積計(jì)算），然后以1.0 BV/h的洗脫流速依次用12 BV純化水、2 BV的35%乙醇洗脫除雜，再用65%乙醇洗脫，即得梔子提取液;經(jīng)減壓濃縮、干燥、粉碎，即得梔子提取物（色價(jià)>500、產(chǎn)率=2.11%）。該工藝經(jīng)3批中試生產(chǎn)驗(yàn)證，穩(wěn)定、可靠，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。

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（收稿日期：2018-03-02? 本文編輯：王? ?蕾）