?；撬釋π募〕衫w維細(xì)胞作用解析

王立英 卞良奇 蘇小偉 蘇海燕 劉絮 劉楠楠

摘?要?研究了?；撬幔═aurine， Tau）對新生大乳鼠心肌成纖維細(xì)胞（Myofibroblasts， myoFbs）增殖的抑制作用，并探討其作用機(jī)制。應(yīng)用血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ， AngⅡ）誘導(dǎo)體外培養(yǎng)新生大乳鼠的myoFbs增殖，建立了心肌纖維化（Myofibrosis， MF）模型，基于甲基偶氮唑鹽法檢測myoFbs增殖。結(jié)果表明，不同濃度（0.03、0.06和0.12 mol/L）Tau均可顯著抑制myoFbs增殖，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。進(jìn)一步應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)、激光共聚焦顯微鏡及 ELISA方法檢測了活性氧（Reactive oxygen species， ROS）、細(xì)胞周期蛋白E（Cell cycle protein E， CyclinE）、核轉(zhuǎn)錄因子κBp65（Nuclear factor-kappa Bp65， NF-κBp65）及轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor-β1， TGF-β1）在myoFbs中的的表達(dá)及含量。研究結(jié)果表明，Tau是通過減少ROS的產(chǎn)生及TGF-β1的表達(dá)、抑制NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位及CyclinE的表達(dá)，抑制myoFbs增殖，起到抗MF的作用。

關(guān)鍵詞?牛磺酸; 心肌成纖維細(xì)胞; 甲基偶氮唑鹽法; 活性氧; 細(xì)胞周期蛋白E

1?引 言

?；撬幔═aurine， Tau）又稱β-氨基乙磺酸，是人體內(nèi)含量極其豐富的自由氨基酸，在心肌組織中占總游離氨基酸含量的60% 以上。研究表明，Tau可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓、調(diào)節(jié)Ca2+濃度的穩(wěn)定及抗氧化等對心肌細(xì)胞起到保護(hù)性作用[1～3]。近年的研究還發(fā)現(xiàn)，Tau在體內(nèi)及體外大鼠心肌纖維化（Myofibrosis， MF）模型中顯示出抗MF的作用[4～6]，但此作用與胞內(nèi)何種信號分子有關(guān)及其作用機(jī)制目前尚不明確。本研究用AngⅡ誘導(dǎo)新生大乳鼠心肌成纖維細(xì)胞（Myofibroblasts， myoFbs）的增殖[1～3]，基于四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（Methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）、激光共聚焦、ELISA及熒光探針2，7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate（DCFH-DA）等定性和定量方法，獲得不同處理因素對對照組（Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM培養(yǎng)液）、模型組、Tau各劑量組對myoFbs增殖的影響，并進(jìn)一步對檢測結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)性對照和統(tǒng)計學(xué)分析，考察Tau抑制myoFbs的增殖是否與活性氧（Reactive oxygen species， ROS）、細(xì)胞周期蛋白E（CyclinE）、核轉(zhuǎn)錄因子κBp65（Nuclear factor-kappa Bp65， NF-κBp65）及轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor-β1， TGF-β1） 等相關(guān)，探討Tau抑制myoFbs增殖的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用機(jī)制。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Olympus CK40倒置顯微鏡（日本Olympus公司）; HYBRID激光共聚焦顯微鏡（日本Lasertec公司）; Sunrise酶標(biāo)儀（美國美谷分子儀器有限公司）; Sorvall低溫離心機(jī)（美國Thermo公司）。

牛磺酸（純度99%，國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）; 血管緊張素Ⅱ、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT， 美國Sigma公司）; Iscove's Modified Dulbecco's Medium （IMDM）、胰蛋白酶（美國Bco公司）; 胎牛血清（杭州四季青生物公司）; 活性氧試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）; TGF-β1檢測試劑盒（上海通蔚實業(yè)有限公司）; 羊抗大鼠CyclinE和NF-κBp65一抗（美國Santa Cruz公司）; S-P試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）; 碘化丙啶（美國Biotium公司）; 二甲基亞砜（DMSO，蘇州聯(lián)雄精細(xì)化工科技有限公司）; DAB顯色液（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）; FITC兔抗山羊二抗 （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。Wistar 大鼠的仔鼠（1～3日齡，雌雄兼用，清潔級），由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。

2.2?MyoFbs分離及培養(yǎng)

取1～3日齡Wistar大鼠乳鼠，無菌開胸取其心臟，用預(yù)冷的D-Hank's沖洗心臟兩次后，將其剪成1 mm3的碎片，用胰蛋白酶（0.125%，w/V）多次消化（37℃， 5 min/次），收集上清液，1200 r/min離心10 min，棄去上清液，用含胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，將其接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。實驗采用第2～3代細(xì)胞。

2.3?實驗分組及給藥

MyoFbs分為正常對照組、模型組、Tau各劑量組。各組細(xì)胞無血清培育12 h后，給予1%血清的IMDM培養(yǎng)基，除對照組外，均給予終濃度為1×107 mol/L的AngⅡ，Tau各劑量組的終濃度分別為0.03、0.06和0.12 mol/L。

2.4?細(xì)胞增殖檢測

將處于對數(shù)生長期的myoFbs制成細(xì)胞懸液，以1×105 cell/mL濃度接種于96孔板，每孔200 μL。分別給予不同的處理因素作用48 h。每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，37℃ 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，于酶標(biāo)儀上490 nm波長測吸光度（A）值，細(xì)胞增殖率（Cell proliferation rate， CPR）按下式計算：

式中， A1和A0分別為藥組和對照組的吸光度。

2.5?TGF-β1含量測定

取第3代myoFbs制成細(xì)胞懸液，以2.5×105 cell/mL濃度接種于24孔板，每孔1 mL。按2.3節(jié)的方法給予不同因素的處理，分別在培養(yǎng)48 h后吸取細(xì)胞上清液，用TGF-β1 ELISA試劑盒檢測TGF-β1的含量。

2.6?CyclinE和NF-κBp65蛋白表達(dá)的檢測

取第3代myoFbs放入預(yù)先放置了10 mm×10 mm蓋玻片的24孔板內(nèi)，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，再經(jīng)無血清培育12 h，在不同條件下處理24 h后，將生長有myoFbs蓋玻片取出，用預(yù)熱PBS洗滌3次， 多聚甲醛（4%，w/V）固定30 min，晾干后用SP法進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色。陽性反應(yīng)胞核呈棕黃色細(xì)密顆粒，陰性對照是用PBS代替一抗染色。應(yīng)用Image-Pro Plus 5.0V （MediaCybernetics公司）圖像分析軟件分析各組CyclinE和NF-κBp65在myoFbs中表達(dá)的平均光密度值。

2.7?活性氧表達(dá)的檢測

24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)myoFbs 48 h，無血清再培育12 h后，各處理因素再作用24 h后，用預(yù)熱的PBS洗滌3次，去除細(xì)胞培養(yǎng)液; 加入終濃度為10 mmol/L的DCFH-DA，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min， 再用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察myoFbs內(nèi)的ROS的水平。

2.8?統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)分析，通過方差分析及q檢驗進(jìn)行組間比較，以p<0.05為有顯著差異且有意義; 實驗數(shù)據(jù)以±s表示。

3?結(jié)果與討論

3.1?Tau對myoFbs增殖的影響

體外實驗中，myoFbs的增殖程度用細(xì)胞增殖率表示，即各實驗組與對照組吸光度（A490為100%）的比值。模型組細(xì)胞增殖率值明顯高于對照組（p<0.01），Tau（0.03～0.12 mol/L）作用myoFbs 48 h后，與模型組相比，均可不同程度降低細(xì)胞增殖率值（p<0.01或p<0.05），且呈現(xiàn)量效關(guān)系。研究表明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（Renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的激活是誘發(fā)及引起 MF 的主要機(jī)制，AngⅡ不僅是常見的刺激信號，也是致器官纖維化的重要因子，尤其可引起MF [5～8]。AngⅡ與 AT1受體結(jié)合后激活蛋白激酶C，隨即啟動胞內(nèi)信號途徑，促進(jìn) myoFbs增殖[6]。從實驗結(jié)果可知，Tau可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的myoFbs增殖，具有抗MF及心肌保護(hù)性作用[12～14]。

3.2?Tau對TGF-β1含量的影響

AngⅡ作用于myoFbs 48 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1含量明顯升高，與對照組相比，差異顯著（p<0.01）; 經(jīng)不同濃度Tau作用后，各組myoFbs細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1的蛋白含量均不同程度減少（p<0.05 或 p<0.01），結(jié)果見表1。在MF過程中，TGF-β1是一種促器官纖維化的因子。體內(nèi)外實驗結(jié)果表明，MF與TGF-β1的異常表達(dá)密切[6，7]。TGF-β1不但能促進(jìn)基質(zhì)蛋白的合成，而且與AngⅡ密切相關(guān)。在MF過程中，TGF-β1與其受體結(jié)合，一方面AngⅡ能提高TGF-β1基因表達(dá); 另一方面TGF-β1能促進(jìn)myoFbs中I、III型膠原mRNA基因及細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）蛋白表達(dá)。TGF-β1對myoFbs的分化、增殖和胞外基質(zhì)的沉積都具有極其重要的作用。離體實驗表明，AngⅡ可促進(jìn)myoFbs分泌TGF-β1，而高表達(dá)的TGF-β1使胞外基質(zhì)合成增加[8，9]。本研究結(jié)果表明，Tau可降低AngⅡ誘導(dǎo)myoFbs中的TGF-β1表達(dá)，抑制MF的發(fā)生。

3.3?Tau對CyclinE表達(dá)的影響

機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞周期蛋白包括Cyclin A、CyclinB、CyclinD、CyclinE、CyclinG及CyclinH，每種周期蛋白都與之關(guān)鍵的蛋白激酶相結(jié)合，并調(diào)節(jié)相應(yīng)激酶活性，從而引起細(xì)胞周期的改變。Cyclin E是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的正向因子，可使細(xì)胞快速通過G0/S期。研究表明，過量表達(dá)的Cyclin E會使細(xì)胞G1期明顯縮短，提前進(jìn)入S 期，干擾核酸的分裂和復(fù)制，干擾染色體的形成，促進(jìn)中心體大量增殖以及干擾有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致MF的發(fā)生?；罨蟮腃yclin E在胞核中表達(dá)為棕黃色或棕褐色顆粒，以胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞。但對Cyclin E在細(xì)胞增殖中的作用，目前研究得較少[7～11]。本研究采用不同濃度Tau處理myoFbs 48 h后，從Cyclin E免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果可見，對照組myoFbs核中Cyclin E的核表達(dá)量較少，AngⅡ組胞中Cyclin E的核表達(dá)較多，明顯高于對照組（p<0.01），不同劑量組的Tau均可抑制Cyclin E的核表達(dá)（p<0.01或p<0.05）。

3.4?Tau對myoFbs的NF-κBp65表達(dá)的影響

在正常情況下，P50/P65/IKB三聚體構(gòu)成NF-κB，是重要的胞核轉(zhuǎn)錄因子，在胞漿中以無活性的形式存在。在氧自由基、細(xì)胞因子等外來刺激作用下，IkB迅速降解，隨即NF-κB被激活?；罨蟮腘F-κB轉(zhuǎn)移至核中，與相應(yīng)的基因調(diào)節(jié)區(qū)域相結(jié)合，啟動基因轉(zhuǎn)錄。研究表明，NF-κBp65與細(xì)胞的增殖關(guān)系密切，通過增加NF-κBp65的核表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。本研究應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)觀察Tau對于NF-κBp65核表達(dá)的影響，不同濃度Tau與myoFbs孵育 48 h后，AngⅡ模型組細(xì)胞核黃褐色顆粒較多且核深染，與對照組相比，差異顯著（p<0.01）。不同濃度Tau可不同程度地減少myoFbs胞核黃褐色顆粒數(shù)量，即NF-κBp65的核表達(dá)減少（p<0.05）。上述結(jié)果說明，Tau可通過抑制NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而抑制myoFbs的增殖，達(dá)到抗MF的作用[7～11]。

3.5?Tau對ROS表達(dá)的影響

細(xì)胞在有氧代謝過程中產(chǎn)生的ROS，其主要功能是使細(xì)胞變性及壞死。此外，ROS可作為重要信號分子，參與到細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，激活轉(zhuǎn)錄因子，影響基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化。本研究利用活性氧檢測試劑盒測定ROS，探索ROS與myoFbs增殖之間的關(guān)系?；钚匝鯔z測試劑盒是利用熒光探針（DCFH-DA）進(jìn)行 ROS檢測，DCFH-DA 本身無熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被胞內(nèi)的酯酶水解，生成DCFH。而 DCFH 不能通透細(xì)胞膜，使探針很容易地被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的 ROS 可氧化無熒光的 DCFH，生成有熒光的DCF。檢測 DCF 的熒光即可知細(xì)胞內(nèi) ROS 的水平[6，8，11]。本研究中采用激光共聚焦顯微鏡觀察 myoFbs 胞漿內(nèi) ROS含量的變化，在 myoFbs 胞漿中可見綠色熒光顆粒，證明有ROS 產(chǎn)生，顆粒熒光越強(qiáng)，表明 ROS 量越高。實驗結(jié)果表明，過量的 AngⅡ可使 NADPH 氧化酶被大量激活，產(chǎn)生過量的ROS，參與了MF及心肌重塑的發(fā)生發(fā)展過程[6，8]。與對照組比較，AngⅡ模型組ROS產(chǎn)生量最多（p<0.01）; ?與模型組相比，Tau各組ROS產(chǎn)生量減少（p<0.01或p<0.05）。應(yīng)用 Image-Pro Plus5.0V圖像分析軟件分析。

4?結(jié) 論

采用不同檢測技術(shù)，考察了Tau對新生大乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖過程不同產(chǎn)物的影響，并進(jìn)行系統(tǒng)性的數(shù)據(jù)解析，結(jié)果表明，Tau通過減少ROS和TGF-β1的生成、抑制CyclinE和NF-κBp65表達(dá)，抑制myoFbs增殖。本研究為臨床上抑制MF及心肌重塑提供了新思路，為相關(guān)生物學(xué)研究提供了有價值的基礎(chǔ)性參考數(shù)據(jù)。

References

1?LUO Can， GUO Lian-Jun. Chinese Pharmacological Bulletin， 2005， 21（9）： 1057-1061

羅 璨， 郭蓮軍. 中國藥理學(xué)通報， 2005， 21（9） ： 1057-1061

2?WANG Yan-Chun， GUAN Feng-Ying， LI Hong， YANG Shi-Jie. Acta Pharmaceutica Sinica， ?2009， 44（6）： 591-596

王艷春， 關(guān)鳳英， 李 紅， 楊世杰. ?藥學(xué)學(xué)報， ?2009， 44（6）： 591-596

3?REN Kuang， WANG Yan-Chun， YANG Shi-Jie. Acta Pharmaceutica Sinica， ?2008， 43（6）： 591-595

任 曠， 王艷春， 楊世杰. ?藥學(xué)學(xué)報， ?2008， 43（6）： 591-595

4?WANG Li-Ying， SU Hai-Yan， LI Chun-Ying， WU Dian-Xiu， LIU Nan-Nan. Journal of Beihua University， ?2016， 17（2）： 200-204

王立英， 蘇海燕， 李春穎， 吳殿秀， 劉楠楠. ?北華大學(xué)學(xué)報， ?2016， 17（2）： 200-204

5?Wang L Y， Li H， Yang S J. Chem. Res. Chinese Universities， ?2012， 28（1）： 84-90

6?WANG Li-Ying， SU Hai-Yan， WANG Xuan， ZHOU Yan， YANG Shi-Jie. Chinese J. Anal. Chem.， ?2015， 43（12）： 1870-1875

王立英， 蘇海燕， 王 璇， 周 艷， 楊世杰. ?分析化學(xué)， ?2015， 43（12）： 1870-1875

7?Hahn H S， Marreez Y， Odley A， Sterbling A， Yussman M G， Hilty K C， Bodi I， Liggett S B， Schwartz A， Dorn G W. Circ. Res.， ??2003， 93（6）： 1111-1119

8?Su S A， ?Yang D， ?Wu Y， ?Xie Y， ?Zhu W， Cai Z J， Jian Shen， ?Fu Z R， Wang Y P， Jia L L， ?Wang Y D， ?Wang J A， ?Xiang M X. Circ. Res.， ?2017， 121（6）： 617-627

9?SUN Hong-Xia， YANG Shi-Jie. Chinese Pharmacological Bulletin， ?2009， 25（1）： 1060-1063

孫紅霞， 楊世杰. ?中國藥理學(xué)通報， ?2009， 25（1）： 1060-1063

10?Wang L Y， Li H， Yang S J， Guan F Y. Afr. J. Pharm. Pharmacol.， ?2012， 6（28）： 2100-2111

11?ZHANG Xing-Guang， YI Gui-Yan， LV Xiao-Feng， LIU Han-Ju， XU Xiu-Ping， JIAO Xiu-Min. Chinese J. Anal. Chem.， ??2012， 40（6）： 955-959

張星光， 依桂艷， 呂肖鋒， 劉漢菊， 許秀萍， 焦秀敏. ?分析化學(xué)， ?2012， 40（6）： 955-959

12?WANG Yan-Chun， LI Hong， YANG Shi-Jie. Chinese Journal of Biologicals， ?2008， 21（1）： 8-11

王艷春， 李 紅， 楊世杰. ?中國生物制品學(xué)雜志， ?2008， 21（1）： 8-11

13?Zhang W Q， Song M S， ?Qu J， ?Liu G H. Circ. Res.， ?2018， 123（9） ： 773-786

14?WANG Yan-Chun， REN Kuang， GU Rao-Sheng， YANG Shi-Jie. Chinese Traditional and Herbal Drugs， ?2009， 40（8）： 1280-1284

王艷春， 任 曠， 顧饒勝， 楊世杰. ?中草藥， ?2009， 40（8）： 1280-1284